Introduction
신경계(nervous system)는 중추신경계(central nervous system) 와 말초신경계(peripheral nervous system)로 구성된다. 말초신경계 의 감각신경(sensory neuron)이 우리 몸에서 다양한 정보를 수집해 중 추신경에 전달하면 중추신경계는 이를 종합해 근육운동과 생체 기능을 조절하는 중요한 기능을 수행한다[1]. 신경세포와 신경세포 간의 정보 전달은 신경세포로부터 합성되어 분비되는 신경전달물질(neurotransmitter) 로 알려진 화학 물질을 통해 이루어진다. 이러한 신경전달물질 은 크게 아세틸콜린(acetylcholine), biogenic amines (norepinephrine, epinephrine, dopamine, serotonin, histamine), 아미노산 (glutamate, glycine), 뉴클레오티드(nucleotides: adenosine, ATP), nitric oxide 등의 가스, prostaglandin 등의 지질분자, 그리고 신경펩 티드(neuropeptides: bradykinin, calcitonin gene-related peptide [CGRP], substance P)로 분류된다[1,2]. 신경세포에서 분비된 신경 전달물질은 신경세포뿐만 아니라 신경교세포, 면역세포 등 주변의 다른 세포에도 작용할 수 있다.
면역체계(immune system)는 병원균에 의한 감염을 감시하고 적절 한 면역반응으로 대응한다. 면역체계의 감염에 대한 방어는 상피층에 의한 방어, 선천면역반응(innate immune response), 적응면역반응 (adaptive immune response)의 3단계로 구성되고 면역반응에 관여 하는 세포들은 다양한 시토카인(cytokine)을 통해 정보를 주고받는다 [3].
그간의 연구로 신경계와 면역체계가 신경전달물질과 시토카인을 통 해 서로 영향을 주고받는다는 것이 잘 알려져 있다[4]. 면역체계에서 매 우 중요한 역할을 하는 T 세포(T cell)와 수지상세포(dendritic cell)가 중추신경계 및 말초신경계 모두에서 사용되는 신경전달물질인 도파민 (dopamine)과 아세틸콜린에 대한 수용체를 발현하고 이들 수용체를 통해 T 세포 반응이 다양하게 조절됨이 보고되어 있다[5,6]. 최근에는 통증과 같은 유해자극을 인지하는 말초신경이 직접 병원균을 인지하기 도 하며 유해자극인지 신경이 “축색 반사(axonal reflex)”를 통해 분비 하는 신경전달물질인 CGRP, substance P, glutamate 등이 T 세포, 수지상세포, 호중구, 큰포식세포 등에 작용해 면역반응을 조절함이 보 고되었다[7].
구강점막에 분포하는 감각신경은 그 축삭의 종말가지가 상피층에까 지 뻗어 있으나 구강 상피세포가 신경전달물질에 직접 반응할 수 있는 지는 알려지지 않았다[7]. 따라서, 이 연구에서는 구강 각질형성세포가 얼마나 다양한 신경전달물질 수용체를 발현하고 신경전달물질에 반응 할 수 있는지를 조사하였다.
Materials and Methods
1. 세포배양
Immortalized mouse oral keratinocyte (IMOK) 세포는 뉴욕주립 대학교(Buffalo, NY, USA) Garrett-Sinha 교수가 제공해주었고[8] CnT Prime (CellnTec, Bern, Switzerland) 배양액으로 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양하였다.
2. 역전사 중합연쇄반응(reverse transcriptasepolymerase chain reaction)
IMOK 세포의 total RNA는 easy-BLUE (17061; iNtRON, Seongnam, Korea)를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라서 분리되었 다. 분리한 total RNA는 역전사 반응액(M170A; Promega, Madison, WI, USA)과 혼합하여 42℃에서 1시간 동안 반응시켜 cDNA를 합성하 였다. 합성된 cDNA는 중합연쇄반응액(M170A; Promega)과 각 유전 자에 특이적인 primer를 이용하여 증폭하였으며, 증폭 산물은 1.5% 아 가로즈겔 전기영동을 한 후 관찰하였다. 중합연쇄반응에 사용된 각 유 전자 primer의 염기서열은 Table 1과 같다. 실험은 2회 반복하였다.
3. 면역조직화학염색
면역조직화학염색(immunohistochemistry) 분석을 위한 조직은 5 주된 BALB/c 생쥐 2마리에서 채취한 하악이 사용되었다. 동물조직의 사용은 서울대학교 동물실험윤리 위원회의 승인(SNU-190115-2- 2) 하에 수행되었다. 포르말린에 고정해 탈회 후 파라핀으로 포매한 조 직절편에서 파라핀을 제거하고, 재수화(rehydration)시킨 후, 먼저 5% bovine serum albumin으로 1시간 동안 blocking하였다. 이어서 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고 phosphate buffered saline (PBS)으로 세척 후, 2차 항체와 1시간 30분 동안 상온에서 반응시키 고 다시 PBS로 세척하였다. 부착된 항체는 3,3′-Diaminobenzidine chromogen (K3468; Dako, Santa Clara, CA, USA)으로 발색하고 hematoxylin (S3309; Dako)으로 대비 염색하였다. 사용된 항체의 종 류와 희석배수는 Table 2에 정리되어 있다.
4. 세포 내 칼슘 측정
신경전달물질 수용체의 기능은 수용체 리간드를 세포에 처리한 후 세포 내 칼슘 농도 변화를 측정하는 방법으로 확인하였다. Fura-2 acetoxymethyl ester (F0888; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 3 μM을 포함하는 serum 없는 세포 배양액으로 37℃에서 50 분간 IMOK 세포를 배양하였다. 이후 Locke’s solution (154 mM NaCl, 5.6 mM KCl, 5.6 mM glucose, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, pH 7.4)으로 세척한 뒤 세포 현탁액을 분주하여 측정에 사용하였다. Fura-2 누출을 방지하기 위해 모든 용액에 250 μM sulfinpyrazone 을 첨가하였다. 형광 강도의 변화는 340 nm와 380 nm excitation 및 500 nm emission 조건으로 spectrophotometer (RF-5301PC; SHIMADZU, Kyoto, Japan)를 이용하여 측정하였다. N-Methyl- D-aspartic acid (NMDA, M3262; Sigma-Aldrich), aCGRP (H- 2265.0500; Bachem, Bubendorf, Switzerland), thapsigargin (TG, T9033; Sigma-Aldrich), carbachol (Y0000113; Sigma- Aldrich), bradykinin (B3259; Sigma-Aldrich)의 효과를 살펴보았다. 실험은 수용체 작용제 종류에 따라 2–3회 수행하였다.
Results
이 연구에서는 구강점막 상피에 발현되는 신경전달물질 수용체를 알 아보기 위해 생쥐 구강 각질형성세포인 IMOK 세포에서 다양한 신경 전달물질 수용체 유전자 발현을 역전사 중합연쇄반응으로 관찰하였다. 먼저 유해자극인지 신경이 분비하는 신경전달물질인 substance P, CGRP, glutamate에 대한 수용체 발현을 살펴본 결과, substance P 수용체 유전자인 Tacr1은 발현되지 않았고, Calcrl과 함께 CGRP 수용 체로 작용하는 Ramp1 및 Ramp3의 유전자 Ramp1 및 Ramp3은 발 현하는 반면 Calcr은 발현되지 않았다. 또한, 다양한 glutamate 수용체 유전자 발현을 살펴본 결과 Grina, Gria3, Grin1, Grin2a, Grin2d 발현 이 확인되었다(Fig. 1A).
이어서 교감신경 및 부교감신경이 분비하는 신경전달물질인 norepinephrine과 아세틸콜린 수용체를 발현하는지 여부가 조사되었 다. 그 결과, norepinephrine 수용체 중 하나인 beta 2 adrenergic receptor (Beta2AR)의 유전자 Adrb2와 아세틸콜린 수용체 중 하나인 cholinergic receptor nicotinic alpha 5의 유전자 Chrna5의 발현을 확인하였다(Fig. 1B). 신경전달물질이면서 염증매개물질로도 유명한 bradykinin과 prostaglandin E의 수용체 발현을 조사한 결과, IMOK 세포는 Bradykinin receptor B1 유전자 Bdkrb1와 Prostaglandin E2 receptor 4 유전자 Ptger4를 발현하고 있었다(Fig. 1C).
유전자 수준에서 살펴본 신경전달물질 수용체가 실제 구강점막 상피 에 발현되는지 단백질 수준에서 확인하기 위해 생쥐 하악 조직을 이용 해 몇 가지 수용체에 대한 면역조직화학염색을 시행하였다. 그 결과, 치 은상피의 전 층에 걸쳐 CGRP 수용체인 Ramp1, glutamate 수용체인 Grina가 세포막에 발현되고 있는 것이 관찰되었고, Ramp1의 발현은 특히 접합상피와 기저세포층에서 높게 관찰되었다(Fig. 2). 이러한 결과 는 신경전달물질 수용체가 구강상피에서 유전자 수준에서 뿐만 아니라 단백질로 발현해 기능할 가능성이 있음을 제시하였다.
IMOK 세포가 발현하는 신경전달물질 수용체가 해당 신경전달물질에 반응하는지 여부를 세포 내 칼슘 농도 측정을 통해 확인하였다. 그 결과, IMOK 세포는 양성대조군으로 사용한 10 μM TG에는 효과적으로 반응 하였지만 glutamate 수용체 작용제인 NMDA (1 μM)나 CGRP 수용체 작용제인 α-CGRP (10 μM)에는 반응하지 못했다(Fig. 3A). 추가적으 로 아세틸콜린 수용체의 작용제인 carbachol과 bradykinin 수용체의 작 용제인 bradykinin을 시험해 본 결과, bradykinin (300 nM)에는 효과적 으로 반응한 반면, carbachol (100 μM)에는 반응하지 못했다(Fig. 3B).
Discussion
이 연구는 신경계에서 발현되는 신경전달물질 수용체가 구강 각질형 성세포에서도 발현되어 기능하는지 여부를 조사하였다. 구강 각질형성 세포는 생각보다 다양한 신경전달물질 수용체를 발현하고 있었으나 작 용제에 대한 반응은 bradykinin 수용체에서만 추가적으로 확인되었고, CGRP 수용체, glutamate 수용체, 아세틸콜린 수용체는 작용제에 반 응하지 않았다.
IMOK 세포는 유해자극인지 신경이 분비하는 신경전달물질인 substance P, CGRP, glutamate 중 CGRP 수용체와 glutamate 수용체 를 발현하였다(Fig. 1A). CGRP 수용체는 CGRP가 결합하는 Calcrl과 Calcrl의 발현과 활성을 조절하는 Ramps로 구성되는데[9], IMOK 세 포는 Ramp1과 Ramp3는 발현했지만 Calcrl을 발현하지 않았기 때문 에 aCGRP에 반응하지 않은 건 당연하다고 할 수 있다. 그렇다면 구강 점막 상피에서도 발현을 확인한 Ramp1이 어떤 기능을 하는지는 추가 연구가 필요하다. 한편, glutamate 수용체는 다양한 단위체 4개의 복 합체로 구성되는데[10], IMOK 세포는 기능적인 NMDA 수용체로 작 용할 수 있는 GluN1/GluN2A/GluN2D를 부호화하는 유전자 Grin1/ Grin2a/Grin2d를 모두 발현함에도 불구하고 NMDA에 반응하지 않았 다. NMDA 수용체 기능은 다양한 인자에 의해 조절된다. 먼저 NMDA 수용체 단위체를 함께 모아서 복합체로 기능하게 하는 단백질(즉 anchoring protein)들의 발현이 IMOK 세포에는 부족할 가능성이 있다. 또한 NMDA 수용체의 기능에는 세포막의 탈분극이 필요한데 IMOK 세 포에는 이에 관련된 이온채널들의 발현이 부족하여 막전압 변화가 충분 하지 않을 수도 있다. 또 다른 가능성으로서 글리신(glycine)이 NMDA 수용체의 공동 작용제(co-agonist)로 작용하는데[10] 사용한 배양액 의 정확한 조성이 알려져 있지 않아 glycine이 충분히 존재하지 않았을 가능성을 배제할 수 없다. NMDA 수용체 기능은 인슐린에 의해서도 조 절되기 때문에[11], 글리신과 인슐린이 충분히 공급되는 생체 내에서는 구강상피에서 GluN1/GluN2A/GluN2D 수용체가 glutamate에 반응 할 가능성을 배제할 수 없다. 따라서 IMOK 세포의 NMDA 수용체의 기 능에 관해서는 추가 연구가 필요하다.
구강에서 자율신경계는 타액분비, 점액분비, 혈관평활근 수축-이완 에 관여하며 구강 점막상피에 자율신경이 분포하고 있다는 증거는 아직 없다[12]. 하지만 교감신경의 신경전달물질인 norepinephrine은 스트 레스 등 환경변화에 따른 교감신경 흥분 시 부신수질에서 분비되어 혈 류를 타고 확산되기 때문에 교감신경말단이 없는 곳에서도 작용할 수 있다. 따라서 구강점막 상피세포에 아드레날린성 수용체가 발현하고 작 용하는지를 밝히는 것은 중요한 의의가 있다. 사람의 구강 각질형성세 포가 norepinephrine 수용체 Beta2AR을 발현하고 epinephrine에 반응해 창상치유에 필요한 세포 이동이 억제된다고 보고되었다[13]. 따 라서, 구강상피에서 norepinephrine 수용체가 자율신경에 반응할 것이 라 유추할 수 있다. 반면, IMOK 세포는 니코티닉(nicotinic) 아세틸콜 린 수용체를 만들 수 있는 Chrna5 유전자를 강하게 발현했음에도 그 작 용제인 Carbachol에 반응하지 않았다. 그 이유로 유전자는 발현하지만 단백질을 발현하지 않을 가능성과 적절한 미세 환경이 조성되었을 때에 만 반응할 가능성을 생각해볼 수 있다. 이는 IMOK 세포에서의 NMDA 수용체 기능 규명과 유사한 접근법의 연구를 필요로 한다.
Bradykinin은 혈관에 작용하는 염증매개 물질로 잘 알려져 있으며 혈 장에 상존하고 염증 상황에선 비만세포가 주로 분비한다. Bradykinin 수용체는 B1 수용체(B1R)와 B2 수용체(B2R)가 있는데, 그 기능이 잘 알려진 혈관뿐 아니라 다양한 조직과 세포에서 발현된다[14]. B1R 과 B2R 모두 뇌신경세포에서도 발현되며 뇌손상 후 그 발현이 증가하 며, B2R이 뇌손상으로 인한 부종에 관여함이 보고되었다[15]. 또한, bradykinin은 통증을 전달하는 감각신경의 B2R에 작용해 직접 통증을 유발하거나 증가시킬 수 있고, B1R도 급성 및 만성 통증에 관여하는 것 으로 알려졌다[14]. 그 밖에 bradykinin은 암세포의 증식과 전이에 관 여하는 것이 알려져 있으나[14,16], 정상적인 구강 점막상피에서 기능 은 알려져 있지 않다. Bradykinin이 구강 점막상피에 작용해 어떤 생 리반응을 유발하는지 추가 연구가 필요하다. Bradykinin 수용체는 Gprotein 및 phospholipase C 신호경로를 통해 생리반응을 나타내기 때문에 구강 점막상피 세포에서 phospholipase C-의존적인 칼슘 신 호가 어떠한 생리적 기능을 나타내는지도 중요한 질문이 될 것이다.
이러한 결과들은 구강 각질형성세포가 몇 가지 신경전달물질에 반응 할 가능성을 보여준다. 상피의 장벽기능은 감염에 대한 1차 방어선으로 매우 중요한 역할을 한다. 구강상피에 분포하는 신경말단이 분비하는 신경전달물질이 구강상피의 항상성 유지에 관여할 가능성에 대한 더욱 심도 깊은 연구가 필요함을 제기하고 있다.
