Introduction

Lautropia mirabilis 는 사람의 혀 후방 타액으로부터 분리되어 새 로운 종으로 확립된 것으로, 그람 음성이면서 통성 혐기성(호기성 상 태에서 더 잘 자람)인 구형 세균이다[1]. 이들은 3–9개의 편모를 가지 고 있고, 원형 운동(circular movement)을 하는 특성을 갖는 세균 종 (species)으로 보고되었다[1]. 현재까지 Lautropia 속(genus)에는 L. mirabilis와 사람의 치면세균막에서 분리된 Lautropia dentalis 두 종 만이 있는 것으로 보고되었다[2].

치주질환의 분자 역학 조사에 의하면, L. mirabilis는 성인과 소아의 치주질환에 이환된 치아보다는 건강한 치아의 치은연하치면세균막에서 검출빈도가 더 높은 것으로 보고되었다[3-6]. 또한, 클로로헥시딘을 가 글 용액으로 사용했을 때, 치은염의 감소와 더불어 L. mirabilis의 검출 빈도도 증가하는 것으로 보고되었다[7]. 이러한 연구 결과들에 의하면, L. mirabilis는 치주질환에 이환된 치아보다는 건강한 치아의 치은연하 치면세균막에 우세하게 존재함을 알 수 있었다. 하지만, L. mirabilis는 낭포성 섬유염 환자의 가래(sputum) [8], 복막 투석 관련 복막염(peritoneal dialysis-associated peritonitis) 병소[9]에서 분리된 연구 결 과에 의하며, 구강이 아닌 다른 장기에서는 병원성 세균으로 작용한다 는 것을 알 수 있었다.

앞에서 소개한 치주질환 분자 역학 연구에서는 16S ribosomal RNA gene (16S rDNA) 기반 마이크로어레이 기법이나 차세대 핵산염기서 열결정법을 이용하여 얻은 결과들이다[3-7]. 이러한 방법들은 많은 세 균 종을 대상으로 정성적 및 정량적으로 검출할 수 있다는 장점은 있지 만, 신속성과 정확도는 실시간중효효소연쇄반응법(quantitative realtime polymerase chain reaction, qPCR)보다는 떨어지는 단점이 있 다. qPCR 법을 시행하기 위해서는 세균 종-특이 PCR 프라이머 쌍 개 발이 필수적이다. 현재까지 L. mirabilis를 종-특이적으로 검출할 수 있 는 qPCR 프라이머 쌍은 개발되지 않았다. 그러므로 본 연구는 치주질 환과 같은 구강 세균 감염성 질환과 L. mirabilis와의 분자 역학 연구 에 사용하기 위해, 세균 종간 상동정이 잘 보존된 부분과 상이한 부분 이 잘 알려진 RNA 중합효소 소단위 베타 유전자(DNA-directed RNA polymerase subunit beta gene, rpoB) [10] 핵산염기서열을 바탕으 로 L. mirabilis 종-특이 qPCR 프라이머 쌍을 개발하기 위하여 시행되 었다.

Materials and Methods

1. 세균 및 세균 배양

L. mirabilis 종-특이 qPCR 프라이머 쌍을 개발하기 위해 사용된 균 주들은 Table 1과 같다. 이 균주들은 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea), CCUG (Culture Collection, University of Göteborg, Göteborg, Sweden), 한 국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, Biological Resource Center, Daejeon, Korea) 또는 ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 얻 거나 구입하여 사용하였다.

Neisseria mucosa 및 Streptococcus spp. 균주들은 brain heart infusion (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) 배지를 이용하여 5% CO₂를 공급한 37℃ 배양기에서 배양하였다.

Aggregatibacter actinomycetemcomitans 균주는 tryptic soy broth (TSB, Difco Laboratories)에 0.6% yeast extract, 5% horse serum, 75 μg/mL bacitracin 및 5 μg/mL vancomycin (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 첨가한 배지[11]에서 배양하였다. Treponema denticola 균주는 ATCC에서 권장하는 1494 modified NOS medium (https://www.atcc.org/~/media)을, Tannerella forsythia 균주는 TSB에 5 μg/mL hemin, 10 μg/mL N -acetyl muramic acid, 5% sheep blood를 첨가한 배지에서 배양하였다. 그 외 균주들은 TSB에 0.5% yeast extract, 0.5 mg/mL cysteine HCl-H₂O, 5 μg/mL hemin 및 1 μg/mL vitamin K₁이 첨가된 배지 를 이용하여 배양하였다. 이들 균주는 혼합가스(85% N₂, 10% CO₂, 5% H₂)가 공급되는 37℃ 혐기성 세균배양기(BACTRONEZ, Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA)에서 배양하였다.

2. qPCR 프라이머 설계

L. mirabilis 를 종-특이적으로 검출하기 위한 qPCR 프라이머 쌍 은 L. mirabilis NCTC 12852^T의 rpoB (GenBank accession no. LR134378 중 902,665..902,689 nts)와 Lautropia dentalis KCOM 2505^T의 rpoB (GenBank accession no. NZ_RRUE01000002 중 206,735..210,850 nts) 핵산염기서열을 바탕으로 PrimerSelect 프 로그램(DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)을 이용하여 설계하였다. 설계된 qPCR 전방 프라이머(RTLam-F4) 염기서열은 5′-GCC GGC CAT CTT GTC ACC A-3′였으며, 후방 프라이머(RTLam-R3) 염기 서열은 5′-CTA CCT GAA GGA TCT GGA CCG CTA C-3′였다. 이 들 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍은 Bioneer 사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 제작하였으며, 이들에 의해 예상되는 PCR 산물 크 기는 244 bp였다.

3. 세균 지놈 DNA 추출

본 연구에서 PCR 및 qPCR의 주형으로 사용될 균주들의 지놈 DNA 는 CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) 방법에 따라 추출하 였다[12]. 세균 지놈 DNAs의 농도와 순도(purity)는 자외선 비색정량 기(Epoch^TM Microplate Spectrophotometer, BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 260과 280 nm 파장에서 흡광 도를 측정하여 조사하였다.

4. 온도 구배(gradient) PCR 및 qPCR 프라이머 쌍의 종-특이성 검증

앞에서 설계된 L. mirabilis 종-특이 qPCR 프라이머 쌍(RTLam- F4/RTLam-R3)의 최적 결합 온도(annealing temperature)를 정하 기 위하여 L. mirabilis KCOM 3484와 Lautropia dentalis KCOM 2505^T의 지놈 DNA를 주형으로 사용하여, 온도 구배 PCR를 수행하 였다. PCR은 Bioneer 사(Korea)의 AccuPower^® PCR PreMix와 MyGenie^TM 96 Gradient Thermal Block을 사용하여[11] 수행하였 으며, 이때 1 pmole/μL씩의 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머들 과 세균 지놈 DNA 4 ng을 PCR 반응 용액에 첨가하여 반응시켰다. 이 때 PCR 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 10분간 전변성 처리하였고, 95℃에서 20초간 변성, 58℃, 60℃, 62℃, 64℃, 66℃, 68℃, 70℃ 또는 72℃에서 20초간 결합, 72℃에서 20초간 중합과정을 30회 시행 하였으며, 72℃에서 10분간 최종 중합과정을 시행하였다. 증폭된 PCR 산물은 GoodView^TM Nucleic Acid Stain (SBS Genetech Co., Beijing, China)로 염색한 후, UV transilluminator를 이용하여 관찰하였 다.

앞에서 설계된 L. mirabilis 종-특이 qPCR 프라이머 쌍(RTLam- F4/RTLam-R3)의 종-특이성은 L. mirabilis KCOM 3484와 구강 세 균 36종의 표준균주 지놈 DNAs를 주형으로 이용하여 PCR 법으로 조 사하였다. 이때 PCR 조건은 결합과 중합과정을 72℃에서 20초간 시행 한 것을 제외하고는 온도 구배 PCR 조건과 같았다.

5. qPCR을 이용한 민감도(검출 한계) 조사

L. mirabilis-특이 qPCR 프라이머 쌍(RTLam-F4/RTLam-R3)의 민감도는 qPCR 법으로 측정하였다. qPCR은 TOPreal^TM qPCR 2X PreMix (Enzynomics, Daejeon, Korea)와 Exicycler^TM 96 Real- Time Quantitative Thermal Block (Bioneer)을 이용[11]하여 실시 하였다. qPCR 반응을 위해, 60 pmoles의 RTLam-F4와 RTLam- R3 프라이머, 4 ng에서 4 fg까지 10배씩 희석된 L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA를 각각의 qPCR 2X PreMix가 들어 있는 PCR tube 에 넣고, 최종 반응물이 50 μL가 되도록 diethyl pyrocarbonatetreated water를 첨가하였다. qPCR은 95℃에서 2분간 전변성 처리한 후, 95℃에서 10초간 변성, 72℃에서 20초간 결합 및 중합과정을 40 회 반복하여 수행하였다. 그 후 65–94℃에서 1℃씩 1초간 반응시켜 형 광도를 측정한 melting curve를 얻어, 비정상적인 qPCR 증폭물 유무 를 확인하였다.

Results

설계된 L. mirabilis 종-특이 qPCR 프라이머 쌍(RTLam-F4/ RTLam-R3)의 최적 결합 온도를 정하기 위한 온도 구배 PCR을 시행 한 결과, 사용된 모든 온도 범위(58–72℃)에서 L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA를 주형으로부터 예상되었던 244 bp 크기의 PCR 산 물이 증폭되었다(Fig. 1). 반면 대조군으로 사용된 L. dentalis KCOM 2505^T의 지놈 DNA를 주형으로 온도 구배 PCR을 한 경우는 모든 온 도 범위에서 PCR 산물이 증폭되지 않았다(Fig. 1). 이러한 결과를 바탕 으로 가장 엄격한(stringency) 조건에 해당하는 72℃를 일반 PCR 및 qPCR의 최종 결합 온도로 정하였다.

RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍의 L. mirabilis 종-특이성을 검증하기 위해, L. mirabilis와 가장 유전학적으로 가까운 종인 L. dentalis를 포함한 37종의 균주 지놈 DNAs를 주형으로 일반 PCR을 시행 하였다. 그 결과 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍은 L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA를 주형으로 한 경우에서만 PCR 산물(244 bp)이 증폭되었고, 나머지 36개 구강 균주들의 지놈 DNAs를 주형으로 한 경우에서는 PCR 산물이 생성되지 않았다(Fig. 2).

L. mirabilis 종-특이 qPCR 프라이머 쌍(RTLam-F4/RTLam- R3)의 민감도(검출 한계)를 측정하기 위해 L. mirabilis KCOM 3484 의 지놈 DNA를 이용하여 qPCR을 수행하였다. 그 결과 RTLam-F4/ RTLam-R3 프라이머 쌍은 L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA 4 ng부터 40 fg까지 검출할 수 있었다(Table 2, Fig. 3).

RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍에 의한 L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA 상의 표적 유전자인 rpoB 이외의 영역을 주형으로 하 는 비특이적 PCR 산물이 증폭되었는지를 알아보기 위하여 melting curve 분석을 시행하였다. 그 결과, melting curve가 단일한 패턴을 보였으며, 온도 변화에 따른 형광 감도의 또 다른 peak가 보이지 않았 다(Fig. 3C). 이러한 결과로 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍에 대한 표적 유전자인 rpoB를 주형으로 한 PCR 산물만이 증폭되었음을 알 수 있었다.

Discussion

본 연구에서 설계된 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍은 일반 PCR에 의해, L. mirabilis를 종-특이적으로 검출할 수 있음이 확인되 었다(Fig. 2). 또한, 미국 국립보건원에서 제공하는 Blastn 프로그램 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 RTLam- R3 프라이머 핵산염기서열(25개 뉴클레오타이드로 구성)의 상동성 검사를 시행한 결과, 25개 염기서열과 100% 일치하는 유전자는 L. mirabilis NCTC 12852^T 균주의 rpoB 이외는 없었다. 25개 염기서열 중, 20개가 연속적으로 100% 일치하는 해양 미생물 균주(Alcanivorax sp. isolate HT1; GenBank accession no. CP080267)가 있었지만, RTLam-R3 프라이머 핵산염기서열의 3’-말단에서 연속적으로 존재하 는 2개의 뉴클레오타이드와는 상동성이 없었다(데이터는 제시 안 함). 반면에 19개 뉴클레오타이드로 구성된 RTLam-F4 프라이머의 핵산염 기서열과 상동성이 100%인 균주는 100개 이상이 존재하였다(데이터 는 제시 안 함). 이는 RTLam-F4 프라이머 핵산염기서열은 rpoB의 상 동성이 잘 보존된 영역에 속하는 것을 시사한다. 두 개의 PCR 프라이 머가 표적 유전자의 핵산염기서열과 상동성이 높을수록, 표적 유전자 가 증폭될 수 있는 특성을 갖는다. 그러므로, Blastn 프로그램을 이용한 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍의 핵산염기서열 상동성 조사에 의해서도, 이들 프라이머 쌍은 L. mirabilis 종-특이성이 있음을 재확인 할 수 있었다.

RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍의 민감도 조사 결과에 의하 면, L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA를 40 fg까지 검출할 수 있음 을 알 수 있었다(Table 2, Fig. 3). 아직 L. mirabilis KCOM 3484 지 놈 DNA 핵산염기서열이 결정되지 않았다. 만약 L. mirabilis NCTC 12852^T와 L. mirabilis KCOM 3484 지놈 핵산염기서열 크기가 같다 고 가정하면, RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍에 의해, L. mirabilis KCOM 3484 몇 마리까지 검출할 수 있는지를 계산할 수 있 다. 지놈 핵산염기서열이 완전히 해독된 L. mirabilis 표준균주(NCTC 12852^T) 지놈 크기가 약 3.17 Mb이고(GenBank accession no. NZ_ LR134378), rpoB가 1 copy 존재한다는 것을 고려하면, RTLam-F4/ RTLam-R3 프라이머 쌍은 약 11.5마리의 L. mirabilis KCOM 3484 를 검출할 수 있음을 알 수 있었다(Table 2). 이는 세균 1마리의 지놈 DNA 질량을 몰(mole) 개념으로 계산한 결과이다. 즉, 세균의 1몰은 6.02 × 10²³개이고, 뉴클레오타이드 1 bp의 평균 분자량이 660 gm 이므로, 지놈 크기가 약 3.17 Mbp인 L. mirabilis NCTC 12852^T의 세 균 1몰 지놈 DNA 질량은 ‘(3.17 × 10⁶) × 660 gm’이라 할 수 있어, 세균 1마리 지놈 DNA 질량은 ‘[(3.17 × 10⁶) × 660 gm] ÷ 6.02 × 1023’, 즉, ‘3.45 fg’이다. RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍이 L. mirabilis KCOM 3484 균주 40 fg의 지놈 DNA까지 검출할 수 있으므 로, 약 11.5 (40 fg/3.45 fg) 마리의 L. mirabilis KCOM 3484 균주를 검출할 수 있다고 계산할 수 있다.

본 연구에서 PrimerSelect 프로그램을 이용하여 RTLam-F4/ RTLam-R3 프라이머 쌍을 설계할 때, 최적 결합 온도(optimal annealing temperature)는 60.5℃로 제시되었다. 하지만, 실제적인 결 합 온도는 온도 구배 PCR을 시행하여 결정할 것을 제안한 보고가 있 었다[13]. 본 연구에서 RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍의 최종 결합 온도를 결정하기 위해, L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA와 L. mirabilis 종과 분류학적 측면에서 가장 가깝고, rpoB 핵산염기서 열 상동성이 가장 높은 L. dentalis KCOM 2505^T의 지놈 DNA를 이 용하여 온도 구배 PCR을 시행하였다. 그 결과, 모든 온도 영역에서 음 성 대조군 격인 L. dentalis KCOM 2505^T 지놈 DNA를 주형으로 이 용할 경우에서는 PCR 산물이 증폭되지 않았다. 반면에 L. mirabilis KCOM 3484 지놈 DNA를 주형으로 온도 구배 PCR을 시행한 결과, 58–66℃ 사이에서 증폭된 PCR 산물 밴드의 밝기와 크기는 비슷하였 고, 68–72℃에서 증폭된 PCR 산물의 밝기는 연하였고, 크기는 약간 작았기 때문에, 66℃를 최종 결합 온도로 정할 수 있었지만(Fig. 1), 본 연구에서 사용된 L. mirabilis KCOM 3484의 rpoB 핵산염기서열이 결 정되지 않았고, 실험에 이용된 L. mirabilis 균주가 하나(KCOM 3484) 라는 점 등을 고려하여, RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍의 종-특 이성을 높이기 위해 가장 혹독한 조건인 72℃를 최종 결합 온도로 결정 하였다.

이상의 결과를 종합하면, RTLam-F4/RTLam-R3 프라이머 쌍은 L. mirabilis에 대한 종-특이성 및 민감도가 뛰어나고, 향후 L. mirabilis와 구강 세균 감염성 질환과의 분자 역학 연구에 이용될 수 있을 것으로 생 각한다.