Introduction

Fusobacterium hwasookii 는 그람 음성의 혐기성 세균으로 한국 인의 치주질환에 이환된 치아의 치은연하치면세균막에서 분리되어 새 로운 종으로 보고되었다[1]. 현재까지 F. hwasookii 균종은 한국인에 서 분리된 5개 균주(ChDC F128^T, ChDC F145, ChDC F174, ChDC F206, and ChDC F300)만이 보고되었다.

세균 종 수준에서의 분류에 있어 중요한 기준은 16S ribosomal gene (16S rDNA) 핵산 염기서열비교분석법과 세균 지놈 핵산염기서 열 기반의 상동성 비교법이다[2,3]. 즉, 분류가 필요한 균주 16S rDNA 의 상동성이 기존 세균 종의 표준균주와 98.6% 이상이면서, 지놈 핵산 염기서열을 바탕으로 digital DNA-DNA hybridization이라 할 수 있 는 genome-to-genome distance 분석법 또는 average nucleotide identity (ANI) 분석법에 의한 값이 각각 70% 이상 또는 94–95% 이 상이면, 이들이 같은 종으로 분류할 수 있다[3]. ANI 분석법에 의하면, 비교하고자 하는 두 균주의 지놈 핵산염기서열 중 60% 이상이 비교 대 상이 되어야 한다는 조건이 있다[4]. 이는 같은 세균 종이라도 유전자 핵 산염기서열은 40%까지 다를 수 있다는 것을 의미한다.

세균 균주의 보존 과정에서 균주 수준에서의 동정을 위해, 균주-특이 DNA 프로브 핵산염기서열을 기반으로 균주-특이 polymerase chain reaction (PCR) 프라이머가 개발되어 보고되었다[5-7]. 본 연구는 5개 F. hwasookii 균주 각각의 지놈 핵산염기서열의 상동성 비교 분석을 통 해 각 균주에만 존재하는 유전자를 찾고, 해당 유전자의 핵산염기서열 을 바탕으로 각 균주를 동정할 수 있는 균주-특이 PCR 프라이머를 개 발하기 위해 시행되었다.

Materials and Methods

1. 세균 및 세균 배양

본 연구에서 사용된 균주들은 Table 1에 정리하였다. 이들 균주들 은 한국구강미생물자원은행(Korean Collection for Oral Microbiology, Gwangju, Korea), American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA), 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, Biological Resource Center, Daejeon, Korea) 및 Culture Collection, University of Göteborg (CCUG, Göteborg, Sweden) 에서 분양받아 사용하였다.

Fusobacterium spp., Capnocytophaga spp., Prevotella spp., Leptotrichia buccalis , Porphyromonas gingivalis , Campylobacter rectus, Tannerella forsythia 및 Selenomonas noxia 균주들 은 tryptic soy broth (BD Diagnostics, Spark, MD, USA)에 0.05% cysteine HCl-H₂O, 0.5% yeast extract, 5 μg/mL hemin 및 2 μg/mL vitamin K₁이 첨가된 배지를 이용하여 85% N₂, 10% CO₂, 5% H₂ 가스를 공급한 37℃ 혐기성 세균배양기(Bactron I; Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR, USA)에서 배양하였다. Streptococcus spp., Actinomyces naeslundii, Neisseria meningitidis 균주들은 brain heart infusion (BD Diagnostics) 배지를 이용하여 37℃, CO₂를 공급하는 세균배양기(Thermo Forma, Waltham, MA, USA)에서 배양하였다[8].

2. F . hwasookii 5개 균주에 대한 균주-특이 PCR 프라이머 쌍 설계

본 연구에서 사용된 5개의 F. hwasookii 균주들의 지놈 핵산염기서 열(Table 2)을 바탕으로, 각 균주에만 존재하는 유전자를 찾기 위해, 웹 사이트(http://sanger-pathogens.github.io/Roary)에서 제공하는 대량의 지놈 핵산염기서열 데이터를 빠르게 분석할 수 있는 Roary 프로 그램[9]을 이용하여 각각의 균주들에만 존재하는 유전자를 검색하였다. 이들 중에서 기능이 밝혀지지 않은 유전자의 핵산염기서열을 바탕으로, PrimerSelect 프로그램(DNASTAR Inc., Madison, WI, USA)을 이 용하여 PCR 프라이머 쌍을 설계하였다. 이들의 핵산염기서열 및 예상 되는 PCR 증폭물의 크기는 Table 3에 정리하였다. 이들 PCR 프라이 머들은 바이오니아사(Daejeon, Korea)에 의뢰하여 제작하였다.

3. F . hwasookii 5개 균주에 대한 균주-특이 PCR 프라이머들의 종-특이성 및 민감도(검출 한계) 검증

본 연구에서 이용된 균주들의 지놈 DNA는 CTAB (cetyltrimethylammonium bromide) 방법에 따라 추출하였다[10]. 추출된 지놈 DNAs는 260 nm 파장에서의 흡광도를 비색정량기(Epoch^TM Microplate Spectrophotometer; BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 측정하였다.

본 연구에서 설계한 F. hwasookii 5개 균주 각각에 대한 PCR 프라이 머 쌍들의 균주 특이성 검증은 AccuPower^® PCR PreMix (Bioneer) 와 MyGenie^TM 96 Gradient Thermal Block (Bioneer)을 사용하였 다. 즉, PCR PreMix 반응 튜브에 2 ng의 지놈 DNA, 각각의 프라이머 쌍을 1 pmole 넣고, 최종 20 μL가 되도록 나머지는 멸균된 증류수를 넣었다. PCR 반응은 전변성 과정(95℃에서 5분) 후, 변성과정(95℃에 서 30초), 결합과정(Table 3의 각 균주에 해당하는 온도에서 30초), 중 합과정(72℃에서 30초) 등을 30회 시행하고, 최종 중합과정(72℃에서 5분)을 시행하였다. PCR 증폭물 확인은 아가로스 젤을 매질로 이용하 여 전기영동하고, GoodView^TM Nucleic Acid Stain (SBS Greetech, Beijing, China)으로 염색하여 UV transilluminator로 확인하였다.

본 연구에서 설계된 F. hwasookii 5개 균주 특이 PCR 프라이머 쌍들 의 민감도는 각각의 균주 지놈 DNA를 2 ng부터 2 fg까지 10배씩 순차 적으로 희석하여 PCR 주형으로 이용하였으며, 앞에서 시행한 균주 특 이성 검증을 위한 PCR과 같은 조건에서 PCR을 시행하여 측정하였다.

Results

F. hwasookii 5개 균주 각각에 대한 균주-특이 PCR 프라이머 쌍을 개발하기 위해서, 이들 균주들의 지놈 핵산염기서열을 미국국립보건원에 서 제공하는 Genome 검색 프로그램(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 내 려받아, 각 균주에만 있는 유전자를 Roary 프로그램[9]을 이용하여 분석 하였다(Supplementary Tables 1–5). 그 결과, KCOM 1249^T, KCOM 1253, KCOM 1256, KCOM 1258, KCOM 1268 균주 각각에만 존 재하는 유전자 수는 282, 70, 279, 149, 227개였다(Supplementary Tables 1–5). 이들 중, 균주-특이성을 높이기 위해, 아직 기능이 밝혀지 지 않은 유전자(hypothetic gene)를 무작위로 골라서 균주-특이 PCR 프라이머 쌍을 설계하기 위한 주형 유전자로 정하였다(Table 3).

F. hwasookii 5개 균주 각각에 대한 PCR 프라이머 쌍의 균주-특 이성을 F. hwasookii와 유전학적으로 유사한 종인 Fusobacterium spp.와 L. buccalis 균주들의 지놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행 하여 조사하였다. 그 결과 5개 프라이머 쌍 모두 각각의 표적이 되는 F. hwasookii 균주 지놈 DNA를 주형으로 한 경우에서만 예상되는 크기 의 PCR 증폭물이 생성되었다(Fig. 1). 또한, F. hwasookii 5개 균주 각 각에 대한 PCR 프라이머 쌍의 균주-특이성을 17개 구강 내 세균 종 각 각의 표준균주 지놈 핵산염기서열을 주형으로 PCR을 수행하여 조사한 결과에서도, 각각의 표적이 되는 F. hwasookii 균주 지놈 DNA를 주형 으로 한 경우에서만 PCR 증폭물이 생성되었다(Fig. 2).

본 연구에서 설계한 F. hwasookii 5개 균주 각각에 대한 균주-특 이 PCR 프라이머 쌍의 민감도(검출한계)를 측정한 결과, F128-F7/ F128-R7, F174-F2/F174-R2, F206-F3/F206-R3과 F300-F1/ F300-R2 쌍들은 각각 F. hwasookii KCOM 1249^T, F. hwasookii KCOM 1256, F. hwasookii KCOM 1258 및 F. hwasookii KCOM 1268 균주 지놈 DNA 2 pg까지 검출이 가능하였고, F145-F1/F145- R1 쌍은 F. hwasookii KCOM 1253 균주 지놈 DNA 0.2 pg까지 검 출할 수 있었다(Fig. 3).

Discussion

본 연구는 F. hwasookii KCOM 1249^T, F. hwasookii KCOM 1253, F. hwasookii KCOM 1256, F. hwasookii KCOM 1258 및 F. hwasookii KCOM 1268 각각의 지놈 DNA 핵산염기서열을 Roary 프 로그램을 이용하여, 각각의 균주들에만 존재하는 유전자 핵산염기서열 을 바탕으로 균주-특이 PCR 프라이머 쌍을 개발하기 위해 시행되었다. 그 결과 F. hwasookii KCOM 1249^T, F. hwasookii KCOM 1253, F. hwasookii KCOM 1256, F. hwasookii KCOM 1258 및 F. hwasookii KCOM 1268 각각의 균주를 특이적으로 검출할 수 있는 F128- F7/F128-R7, F145-F1/F145-R1, F174-F2/F174-R2, F206- F3/F206-R3 및 F300-F1/F300-R2 쌍들이 설계되었으며, 25종 구 강 세균 균주들의 지놈 DNA를 이용하여 균주-특이성이 있음을 확인하 였다(Figs. 1 and 2). 또한, 이들 프라이머 쌍들은 F. hwasookii 5개 균주 각각의 지놈 DNA를 2 pg 또는 0.2 pg까지 검출할 수 있음을 알 수 있었다(Fig. 3).

본 연구에서 설계된 F. hwasookii 5개 균주 각각에 대한 프라이 머 쌍들의 균주-특이성을, 미국국립보건원에서 제공하는 핵산염기 서열 데이터베이스를 기반으로 한 Blastn 검색 프로그램(https:// blast.ncbi.nlm.nih.gov)을 이용하여 추가로 조사하였다. 그 결과, F. hwasookii KCOM 1249^T와 F. hwasookii KCOM 1253 균주 각각 에 대한 균주-특이 프라이머 쌍들(각각 F128-F7/F128-R7와 F145- F1/F145-R1)의 전방 및 후방 프라이머 핵산염기서열 모두에 대한 100% 상동성을 갖는 다른 균주는 검색되지 않았다(데이터 제시는 생 략). F. hwasookii KCOM 1258 균주-특이 PCR 프라이머 쌍 중 전 방 프라이머(F206-F3)의 핵산염기서열과 100% (22/22) 일치하는 부분이 Fusobacterium pseudoperiodonticum KCOM 2555과 F. pseudoperiodonticum KCOM 2653 균주 지놈 핵산염기서열(각각 GenBank accession no. CP024704와 CP024705)에 존재하였지 만, 후방 프라이머(F206-R3)의 핵산염기서열과 상동성이 있는 부분 은 F. pseudoperiodonticum KCOM 2555과 F. pseudoperiodonticum KCOM 2653 균주 지놈 핵산염기서열에는 존재하지 않았다(데 이터 제시는 생략). 또는 전방 및 후방 프라이머들 모두와 상동성이 있 는 균주는 존재하지 않았다. 즉, 본 연구에서 설계된 F128-F7/F128- R7, F145-F1/F145-R1와 F206-F3/F206-R3 프라이머 쌍들은 각 각 F. hwasookii KCOM 1249^T, F. hwasookii KCOM 1253과 F. hwasookii KCOM 1258 균주들에 대한 균주-특이성이 있음을 확인할 수 있었다.

반면에 F. hwasookii KCOM 1256 균주-특이 PCR 프라이 머 쌍이라 조사되었던 전방 프라이머(F174-F2)와 후방 프라이머 (F174-R2) 핵산염기서열은 Fusobacterium nucleatum subsp. polymorphum KCOM 1260의 지놈 핵산염기서열(GenBank accession no. CP21934)의 각각 2,032,435...2,032,412 nts와 2,031,810..2,031,832 nts 핵산염기서열과 95.83% (23/24, 5’에서 5번째 핵산염기서열이 guanine 대신 thymidine임)와 100% (23/23) 상동성을 보였다. 전방 프라이머의 상동성이 95.83%이지만, 결합온 도를 낮출 경우 F174-F2/F174-R2 프라이머 쌍에 의해 F. nucleatum subsp. polymorphum KCOM 1260 지놈 DNA가 증폭될 확률 이 높고, 이때 예상되는 PCR 증폭물의 크기도 626 bp가 되기 때문에, F174-F2/F174-R2 프라이머 쌍은 F. hwasookii KCOM 1256와 F. nucleatum subsp. polymorphum KCOM 1260 균주를 모두 검출 할 수 있을 것으로 판단된다. 또한 F. hwasookii KCOM 1268 균주- 특이 PCR 프라이머 쌍이라 조사되었던 F300-F1와 F300-R2 프라이 머 쌍들의 핵산염기서열을 Blastn 검색 프로그램으로 상동성을 조사한 결과, Fusobacterium sp. oral taxon 203 지놈 핵산염기서열(Gen- Bank accession no. CP016200)의 각각 244,686..244,662 nts와 243,834..243,851 nts에 100% 상동성이 있음을 확인할 수 있었고, 이때 예상되는 PCR 증폭물 크기도 853 bp였다(데이터 제시는 생략). 이는 F300-F1/F300-R2 프라이머 쌍은 F. hwasookii KCOM 1268 과 Fusobacterium sp. oral taxon 203 균주를 동시에 검출할 수 있음 을 의미한다. 이러한 결과는 균주-특이 PCR 프라이머 쌍을 설계할 때 에는 대조군으로 사용되는 균주들의 지놈 DNA를 이용한 종-특이성 조 사를 위한 PCR을 시행하기 앞서, GenBank라는 핵산염기서열 데이터 베이스 기반 상동성 검색 프로그램인 Blastn을 이용한 상동성 검사를 시행해야 함을 시사한다.

이상의 연구 결과를 요약하면, 본 연구에서 Roary 프로그램을 이용 하여 F. hwasookii 5개 균주의 지놈 핵산염기서열 중 각각의 지놈에만 존재하는 유전자를 바탕으로 균주-특이 PCR 프라이머를 설계한 결과, F. hwasookii KCOM 1249^T, F. hwasookii KCOM 1253와 F. hwasookii KCOM 1258 균주들 각각에 대한 균주-특이 PCR 프라이머 쌍 을 개발하였으며, F. hwasookii KCOM 1256/F. nucleatum subsp. polymorphum KCOM 1260 균주들에 대한 특이 PCR 프라이머 쌍 및 F. hwasookii KCOM 1268/Fusobacterium sp. oral taxon 203 균주들에 대한 특이 PCR 프라이머 쌍을 개발하였다. 이들 균주-특이 PCR 프라이머 쌍들은 각각의 균주들의 정도 관리에 사용할 수 있을 것 으로 판단된다. 향후 연구에서 F. hwasookii KCOM 1256과 F. hwasookii KCOM 1268 각각에 대한 균주-특이 PCR 프라이머 쌍 개발이 필요할 것으로 생각된다.