Introduction
구강암(oral cancer)은 입술, 타액선, 혀, 구강인두, 하인두, 편도와 같은 구강 및 인두부에 발생하는 종양을 통칭하는 것으로, 인체에 발생 하는 전체 암의 4–5%를 차지하며, 이 중 편평세포암종이 90%를 차지 한다[1-3]. 편평세포암종은 타고난 림프절 전이능력으로 인해 다른 조 직으로 쉽게 침윤, 침습하여 치료가 쉽지 않으며, 5년 생존율이 약 30% 이하로 예후가 좋지 않다[4,5]. 구강암의 정확한 병인은 알려지지 않았 으나 담배나 알코올의 지속적인 소비가 중요한 요인임은 많은 연구를 통해 밝혀졌으며, 이외 Humanpapilloma와 같은 바이러스 감염, 비위 생적인 구강 청결 상태, 비타민과 단백질 결핍, 자외선 등 노출에 의한 염색체 변이가 원인이 될 수 있다[3,6]. 구강암 치료에는 종양을 절제하 는 외과적 수술요법과 방사선 조사로 감소시키는 방사선 요법, 약물 복 용을 통한 항암요법 등이 있으며, 한 가지만 단독으로 사용하거나 두 가 지 요법 이상을 병행하여 치료한다[5-7]. 그러나 이러한 요법은 위장장 애, 신장기능 부진 등의 부작용을 유발하여, 부작용이 적고 약리효과가 뛰어난 약용작물을 이용하여 그 치료제를 개발하고자 하는 연구가 증가 되고 있다[8-10].
해죽순(Nypa fruticans Wurmb)은 ‘바다에서 나는 죽순’이라는 뜻 으로 바다에서 자라는 새순의 모양이 우리나라의 죽순과 비슷하여 붙여 진 이름이다[11]. 해죽순은 천남성과에 속하는 식물로, 인도, 말레이시 아, 인도네시아 및 미얀마 지역의 부드러운 갯벌, 느린 유속의 강에 서 식하며 재배된다[11,12]. 해죽순의 잎은 차를 우려내기 위해 이용하였 으며 수액에서 설탕을 얻거나 천연 바이오 에탄올 원료로 이용되어왔다 [11,12]. 해죽순에는 chlorogenic acid, protocatechuic acid 등 다 량의 페놀산와 플라보노이드가 함유되어 있으며, 타고난 항염증, 항산 화 및 항균작용으로 인해 전통적으로 치통 치료 등을 위해 사용되어온 약용식물이다[11-13]. 최근 한국에 수입되면서 다양한 생리활성에 대 한 연구가 이루어지고 있으며, 마우스 대식세포에서 nitric oxide의 발 현을 억제함으로써 항산화와 항염증 효과가 보고되었으며, 신경손상 실 험동물모델에서 TRPV1의 발현을 억제함으로써 신경보호효과 및 통증 완화효과에 대한 연구가 보고되어 있다[14-16]. 또, 해죽순 물 추출물 (water extracts of Nypa fruticans Wurmb, WeNFW)을 이용하여 당뇨질환 실험동물에서 항당뇨 및 항산화 효과를 분석한 결과, 식후 포 도당 수치를 개선시킴으로써 당뇨 개선에도 매우 효과적임을 보고하였 다[17]. 그러나, 해죽순에 대한 다양한 생리활성 연구는 미비한 실정으 로, 항암효과에 대한 연구는 이루어지지 않았다.
이에 본 연구에서는 사람 유래 하인두 편평암세포종인 FaDu 세포에 서 WeNFW의 항암효과 및 그 기전을 연구하였다.
Materials and Methods
1. WeNFW 제조 방법
해죽순 10 g을 증류수 400 mL에 넣고 2시간 30분 동안 진탕한 액을 filter paper로 여과한 후, 여과액을 감압농축(Eyela, Tokyo, Japan) 후 동결건조하였다. 건조된 분말은 3차 증류수에 100 mg/mL로 녹여 필터한 후 실험에 이용하였다.
2. 시약
Crystal violet, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)과 4`6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으 며, Live & Dead viability/cytotoxicity kit는 Molecular probe (Eugene, OR, USA)에서 구입하였다. Cell scratcher와 FITC-Annexin V apoptosis detection kit I는 각각 SPL life science (Pocheon, Korea)와 BD Bioscience (San Diego, CA, USA)에서 구입하였다. 1차 항체와 2차 항체는 anti-α-tubulin (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)을 제외하고 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)에서 구입하여 이용하였다. 세포 배양 시 사용된 시약 중 minimum essential medium Eagle (MEM)과 penicillin/streptomycin solution은 WelGene (Daegu, Korea)에서 구입하였으며, fetal bovine serum (FBS)은 ATLAS Biologicals (Fort Collins, CO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
3. 세포 배양
사람 유래 하인두 편평암세포 FaDu와 마우스 fibroblast L929 세포 는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였다. 5% CO2와 37℃가 유지되는 세포배양기에서, FaDu는 10% FBS와 항생제가 함 유된 MEM 배지를 이용하여 배양하였으며, L929는 10% FBS와 항생 제가 함유된 DMEM 배지를 이용하여 배양하였다.
4. 세포독성 분석
WeNFW의 세포독성 효과를 분석하기 위해, FaDu 암세포와 L929 정상세포를 12-웰 플레이트의 각 웰에 2 × 105개의 세포로 접종하 고 부착을 위해 16시간 동안 배양하였다. 배양 후 WeNFW을 0, 0.3, 0.6, 1.2, 2.4 mg/mL로 처리한 후 24시간 동안 반응하였다. 반응 종 료 후, 세포독성 평가를 위해 MTT 용액을 첨가하고 2시간 추가 배양 한 다음 생성된 formazan은 Dimethyl sulfoxide에 용해한 후 microplate reader (Epoch; Bio Tek Instruments, Winooski, VT, USA) 를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 분석은 시료를 처 리하지 않은 대조군의 흡광도를 생존율 100%로 하고 시료를 처리한 실 험군의 흡광도를 대조군과 비교하여 백분율(%)로 표시하였으며, 계산 식은 다음과 같다.
5. Live & Dead assay
Live & Dead viability/cytotoxicity kit (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)는 살아있는 세포와 죽은 세포를 형광 염색하여 세포 생존 여부를 분석하는 실험으로 live-dye인 Calcein-AM은 살아있는 세포의 esterase에 의해 분해되어 녹색 형광을 나타내며, dead-dye 인 Ethd-1 (ethidium bromide homodimer-1)는 죽은 세포의 핵산 과 반응하여 붉은 형광을 나타낸다. FaDu 암세포를 4-웰 chamber slide에 1 × 104 cells으로 접종한 후 부착을 위해 16시간 동안 배양하 였다. 배양 후 WeNFW을 0, 0.3, 0.6, 1.2, 2.4 mg/mL로 처리한 후 24시간 동안 반응하였다. PBS로 가볍게 세정한 다음, Calcein-AM과 Ethd-1의 1:1 혼합용액을 각 well 첨가한 후 37℃ incubator에서 10 분간 반응하였다. 살아있는 세포와 죽은 세포의 형광관찰을 위해 형광 현미경(Eclipse TE2000; Nikon Instruments, Melville, NY, USA) 을 이용하여 관찰하였다.
6. Wound healing assay
FaDu 암세포를 6-웰 플레이트의 각 웰에 4 × 105개의 세포로 접 종하고 부착을 위해 16시간 동안 배양하였다. 세포 스크래처를 이용하 여 각 웰에 동일한 넓이의 상처를 유도하였으며, 부유물 제거를 위해 PBS로 가볍게 세정한 후 세포독성을 일으키지 않는 농도의 WeNFW (0, 0.025, 0.05, 0.1 mg/mL)을 처리하였다. 시료 처리하고 이틀 후, EVOS XL CORE (Thermofisher Scientific, Waltham, MA, USA) 를 이용하여 FaDu 암세포의 wound healing 능력에 대한 WeNFW 억제효과를 분석하였다.
7. 콜로니 형성
FaDu 암세포를 6-웰 플레이트의 각 웰에 1 × 104개의 세포로 접종 하고 부착을 위해 16시간 동안 배양하였다. 배양 후 세포독성을 일으키 지 않는 농도의 WeNFW (0, 0.025, 0.05, 0.1 mg/mL)을 처리하고 24시간 반응하였다. 24시간 후, 세포는 시료가 없는 성장배지에서 7일 간 배양하였으며, 콜로니 확인을 위해 crystal violet 염색을 수행하였 다. 배양한 배지를 제거하고 PBS로 가볍게 세정한 다음 95% 에탄올로 10분간 반응하여 고정하였다. 완전히 건조시킨 후 0.1% crystal violet 용액을 첨가하여 10분간 염색하였으며 증류수를 이용하여 세정한 다음 Canon G16 (Canon, Tokyo, Japan)을 이용하여 염색 정도를 분석하 였다.
8. DAPI staining
DAPI stain은 DAPI 분자가 DNA에 결합하여 cyan색의 형광을 나타 내는 것으로, 세포질 및 핵의 응축과 염색질의 분절화를 통해 세포사멸 (apoptosis)을 확인할 수 있다. FaDu 암세포를 4-웰 chamber slide 에 1 × 104 cells으로 접종한 후 부착을 위해 16시간 동안 배양하였다. 배양 후 WeNFW을 0, 0.3, 0.6, 1.2, 2.4 mg/mL로 처리한 후 24 시간 동안 반응하였다. PBS로 가볍게 세정한 다음 4% paraformaldehyde에 10분간 고정하고 300 nM DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 첨가하여 5분간 염색한 뒤, 형광현미경 (Eclipse TE2000) 하에서 핵의 응축과 염색질의 분절화를 관찰하였다 (20×). 염색질이 응축되고 조각나 있거나 막 투과성이 비정상적으로 증가되어 염색된 핵이 밝게 빛났을 때 세포사멸이 일어난 세포로 판단 하였다.
9. 유세포 분석
FaDu 암세포를 6-웰 플레이트의 각 웰에 4 × 105개의 세포로 접 종하고 부착을 위해 16시간 동안 배양하였다. 배양 후 WeNFW을 0, 0.3, 0.6, 1.2, 2.4 mg/mL로 처리한 후 24시간 동안 반응하였다. 반 응 종료 후, 0.25% trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 수확하고 PBS 로 가볍게 세정한 다음, 1 mL annexin V binding buffer에 FITCAnnexin V/propidium iodide (PI) (BD Bioscience)가 첨가된 혼합 액을 첨가하여 세포를 염색하였다. 염색된 세포는 Gallios flow cytometer (Beckman Coulter Life Science, Indianapolis, IN, USA) 와 Kaluza analysis software (Beckman Coulter Life Science)를 이용하여 세포사멸이 유도된 세포의 정량분석을 수행하였다.
10. 단백질 면역 발색법
FaDu 암세포를 6-웰 플레이트의 각 웰에 4 × 105개의 세포로 접 종하고 부착을 위해 16시간 동안 배양하였다. 배양 후 WeNFW을 0, 0.3, 0.6, 1.2, 2.4 mg/mL로 처리한 후 24시간 동안 반응하였다. 반응 후 PBS로 두 번 세정하고, pro-pret protein extraction buffer (iNtron, Seongnam, Korea)를 이용하여 단백질 분리한 후 BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA)을 이용하여 정량하 였다. 20 ug/lane 단백질을 10%와 14% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis을 이용하여 단백질 크기별로 분 리한 후 polyvinylidene fluoride membrane에 옮겼다. 비-특이적 항 체 반응 방지를 위해, membrane은 5% blocking solution (5% bovine serum albumin in TBS containing 0.1% Tween-20)에서 30 분 동안 blocking하고, 일차항체(cleaved caspase-9, cleaved caspase- 3, cleaved caspase-7, cleaved poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), Bcl-2, Bax, α-Tubulin)를 TBS-T에 1:1,000으로 희석하여 4℃ 조건하에서 overnight 반응하였다. 그 후, TBS-T로 세 척 후 이차항체인 anti-rabbit IgG과 anti-mouse IgG를 1:5,000으 로 희석하여 실온에서 1시간 반응한 다음 TBS-T로 10분씩 세 번 세척 하였다. 결과 분석은 ECL kit (Millipore, Bedford, MA, USA)을 이용 하여 발광하였으며 MicroChemi 4.2 (DNR Bio-Imaging Systems Ltd, Jerusalem, Israel)를 통해 protein band를 가시화하였다.
11. 통계적 유의성
모든 실험성적은 mean ± standard deviation으로 나타내었고, 각 실험군 간의 유의성 검정은 Graphpad prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 이용하여 Tukey t-test를 하였으며, p-value가 0.05 미만(p ＜ 0.05)의 경우에서 통계적 유의성이 있는 것 으로 간주하였다.
Results
1. 마우스 섬유아세포(L929)에서 WeNFW의 독성 평가
마우스의 섬유아세포 L-929에 대한 WeNFW의 독성을 평가하기 위하여 MTT assay를 수행하였다. WeNFW를 다양한 농도(0.3, 0.6, 1.2, 2.4 mg/mL)로 24시간 처리한 결과, 1.2 mg/mL까지 유의할 만 한 세포 증식과 독성은 보이지 않았으나, 2.4 mg/mL을 처리한 군에서 세포 생존율이 약 20% 감소하였다(Fig. 1A).
2. 사람 유래 인두 편평암세포(FaDu)에서 WeNFW의 독성 평가
사람 유래 인두 편평암세포 FaDu에 대한 WeNFW의 독성을 평가 하기 위해 L929세포와 같은 농도로 24시간 처리하였다. 그 결과, 0.3 mg/mL을 처리한 군에서 세포성장이 약 10% 감소하였으며, 이후 농 도-의존적으로 성장이 억제되어 정상세포에 약 20%의 독성을 보였던 2.4 mg/mL에서는 약 75%의 암세포 성장을 억제하였다(Fig. 1B). 또, 살아있는 세포와 죽은 세포를 형광염색하여 WeNFW의 세포독성 효과 를 분석한 결과 농도-의존적으로 살아있는 세포를 나타내는 초록색 형 광이 점차 감소하였으며, 죽은 세포를 나타내는 빨간색 형광이 점차 증 가하는 것을 확인하였다(Fig. 2).
3. 사람 유래 인두 편평암세포(FaDu)에서 WeNFW의 wound-healing 및 콜로니 형성 능력 억제 효과
WeNFW의 암세포 성장억제 효과뿐만 아니라 암세포의 무제한 재생 (증식) 능력 또한 억제할 수 있는지 평가하기 위해 wound-healing 기 법과 crystal violet을 이용한 콜로니 형성을 분석하였다. 그 결과, MTT assay에서 세포독성을 나타내지 않는 농도임에도 불구하고, 0.05 mg/ mL에서부터 암세포의 wound-healing 능력이 현저히 억제되었으며, 콜로니 형성 능력 또한 0.025 mg/mL부터 농도의존적으로 억제되었 다(Fig. 3). 이러한 결과는 WeNFW가 세포독성이 없는 농도에서도 암 화를 지연시킬 수 있음을 시사한다.
4. 사람 유래 인두 편평암세포(FaDu)에서 WeNFW에 의한 핵형 변화 분석
WeNFW의 암세포 성장억제 효과가 세포사멸과 관련 있는지 분석 하기 위해 DAPI stain을 수행하였다. 그 결과, 염색질의 응축과 분절 화와 같은 세포사멸 핵 모양을 가진 세포가 대조군(0 group)에 비해 WeNFW를 처리한 군에서 농도-의존적으로 증가하는 것을 확인하였 다(Fig. 4).
5. 사람 유래 인두 편평암세포(FaDu)에서 WeNFW에 의한 세포사멸 유도 분석
WeNFW의 암세포 성장억제 효과가 세포사멸과 관련이 있으므로 세 포사멸 특수염색물질인 annexin V와 PI를 통해 유세포 분석을 수행 하였다. 세포사멸이 유도되면, 세포 내막에 있는 phosphatidylserine (PS)가 세포 바깥쪽으로 뒤집어지게 되며 PS와 강력한 친화력이 있는 annexin V는 PS와 결합하여 세포사멸이 일어난 세포를 직접적으로 표 적한다. WeNFW에 의한 FaDu 암세포의 세포사멸 정도를 분석하기 위해 Annexin V와 PI 염색 후 유세포 분석을 수행한 결과, WeNFW 의 농도가 증가할수록 live 세포는 점차 감소하였으며 apoptosis 세포 비율은 점차 증가하였다(Fig. 5). 대조군과 비교하여 세포사멸 증가 비 율은 WeNFW이 0.3, 0.6, 1.2 mg/mL일 때 각각 16.1%, 37.1%, 61.2%였다(Fig. 5). 이러한 결과는 WeNFW에 의한 세포 성장억제 효 과가 세포사멸과 관련 있음을 시사한다.
6. WeNFW에 의한 사람 유래 인두 편평암세포(FaDu)의 세 포사멸 기전 분석
세포사멸이 유도되면 caspase들은 기질 단백질의 aspartic acid 잔 기를 자르는 cystein 단백분해효소로 알려져 있다. 따라서, WeNFW 에 의한 FaDu 암세포의 세포사멸효과가 caspase 신호전달 기전에 의 해 매개되는지 확인하기 위해 cleaved caspase들의 발현 여부를 웨스 턴 블랏을 통해 확인하였다. 그 결과, cleaved caspase-9 및 -3의 발 현이 WeNFW의 농도-의존적으로 점차 증가하였으며, 궁극적으로 세 포사멸의 지표인 PARP의 절단을 확인하였다(Fig. 6A). 또, FaDu 암세 포에 WeNFW의 처리는 anti-apoptotic 단백인 Bcl-2의 발현을 감소 시켰으며 pro-apoptotic 단백인 Bax의 발현을 증가시키는 것을 확인 하였다(Fig. 6B). 이러한 결과는 FaDu 암세포에서 WeNFW에 의한 세 포사멸은 caspase 및 미토콘드리아-의존적으로 매개될 수 있음을 시 사한다.
Discussion
해죽순(Nypa fruticans Wurmb)은 니파야자아과의 단형 속인 니 파야자속에 속하는 유일한 종으로, 니파팜이라는 나무의 새순이다 [11,12]. 미얀마나 방글라데시 같은 열대지방의 갯벌 혹은 유속이 거 의 없는 바다에서 자라며, 미얀마에서는 슈퍼푸드로 잘 알려져 있다 [11,12]. 해죽순에는 다양한 비타민과 페놀산, 플라보노이드가 다량 함유되어 있으며, 항염증, 항산화 및 항균효과가 있다고 보고되어 있 으나, 항암활성에 대한 연구는 전무한 실정이다[14-16]. 본 연구에서 WeNFW가 구강암세포(FaDu)의 성장 억제 및 그 기전을 분석함으로 써 해죽순의 항암활성을 분석하였다.
암세포의 가장 대표적인 특징은 제한 없는 과도한 증식이며, 대부분 의 항암제는 이러한 과도한 증식을 세포사멸 유도를 통해 억제하는 기 전을 기반으로 두고 있다[18,19]. 기존의 항암제가 암세포 성장억제에 매우 효과적임에도 불구하고 사용에 제한적인 것은 정상세포의 성장에 도 영향을 미침으로써 많은 부작용을 초래하기 때문이다[20]. WeNFW (0.3, 0.6, 1.2 mg/mL)은 정상세포(L929)의 성장에는 영향을 주 지 않으면서 구강암세포(FaDu)의 성장은 농도-의존적으로 억제하는 것을 확인하였으며, 콜로니 형성 능력 또한 효과적으로 억제하였다. 이 러한 결과는 다른 천연자원 물 추출물들의 항암효능과 일치하는 결과 로, 붉은토끼풀 잎 에탄올추출물은 유방암세포주 MCF-7와 MDAMA- 231의 성장을 농도-의존적으로 억제하였으며, IC50값은 각각 6.8 mg/mL와 0.7 mg/mL였다[21].
WeNFW에 의한 FaDu 암세포의 증식억제 효과가 세포사멸에 의한 것인지 알아보기 위해 DAPI 염색을 수행한 결과, WeNFW에 의해 핵 의 응축과 염색질의 분절화 등 세포사멸의 특징이 점차 증가됨을 확인 하였으며, 이는 다른 여러 추출물들의 암세포 증식억제 기전과 일치하 는 것으로, 오이풀 열수추출물은 대장암세포주(hct-116, RKO)의 성장 을 시간- 및 농도-의존적으로 억제하였으며, DAPI 염색 결과를 통해 추출물의 암세포 증식억제가 세포사멸 기전을 통해 매개됨을 증명하였 다[22]. 세포사멸은 프로그램화된 세포 자멸사로 세포밀도의 항상성 유 지 혹은 외부 항원으로부터 자신을 보호하기 위해 유도되며, caspase 에 의한 내인성 신호전달과 미토콘드리아에 의한 외인성 신호전달을 통 해 유발된다[23]. 외인성 신호전달에는 death-수용체에 리간드가 결합 하여 caspase-8, -9, -7 및 -3 단백질이 절단되고 궁극적으로, DNA 회복기능을 하는 PARP의 절단이 유도되어 세포사멸이 일어난다. 이러 한 caspase들의 활성은 미토콘드리아에 의한 내인성 신호전달 또한 활 성화하여 세포생존에 필요한 요소들을 결핍시켜 세포사멸을 유도한다 [23,24]. WeNFW을 처리한 군에서 caspase-9, -3 및 PARP의 가 수분해가 유도되었으며, 미토콘드리아-의존적 세포사멸인자인 Bcl-2 (항-세포사멸 인자)의 단백발현 감소와 Bax (세포사멸 인자)의 단백발 현 증가를 확인하였다. 이러한 결과는 다른 여러 추출물(붉은토끼풀 잎 에탄올 추출물, 무화과 잎 메탄올 추출물, 리치씨드 에탄올 추출물)들의 다양한 암세포(유방암, 다형교모세포종, 간암, 폐암)의 세포사멸 기전 과 일치한다[21,25-27]. 붉은토끼풀 잎 에탄올 추출물은 유방암세포와 다형교모세포종에서 autophagy를 통해 caspase 세포사멸 기전이 유 발되는 것을 확인하였으며, 무화과 잎 메탄올 추출물은 간암세포 증식 억제효과가 세포사멸과 세포괴사를 통해 유도됨을 보고하였다[26]. 또, 리치씨드 에탄올 추출물의 폐암 세포주의 성장 억제효과가 caspase 신 호전달기전을 통해 매개됨을 확인하였다[27]. 그러나, 해죽순을 이용한 항암제 개발을 위해서는 더 많은 암세포와 동물실험을 통해 그 효과와 기전이 명확히 규명되어야 할 것으로 생각한다.
결론적으로, 본 연구에서는 WeNFW에 의한 사람 인두 편평암세포 FaDu의 증식억제가 caspase- 및 미토콘드리아-신호전달체계를 통해 세포사멸이 매개될 수 있음을 시사한다.
