Introduction

구강암(oral cancer)은 입술, 혀, 치주, 하인두 등 얼굴과 목의 거 의 모든 부위에 발병하는 암을 통칭한다. 미국에서는 2021년에 약 35,540명이 구강암 진단을 새롭게 받았으며, 6,980명이 사망하였고, 2020년도 기준, 전 세계적으로 암 관련 사망의 약 1.8%를 차지하는 것 으로 추산된다[1]. 구강암은 대부분이 편평세포 암종(squamous cell carcinoma)으로, 타고난 림프절 전이 능력으로 인해 다른 조직으로 쉽 게 침윤, 침습하여 치료가 쉽지 않으며, 방사선 요법이나 화학 요법의 유무에 관계 없이 5년 생존율이 약 50%이다[1]. 또, 구강암은 저작, 연 하, 발음, 어깨의 불편함 등의 기능적 장애와 더불어 안모변형 등을 초 래하여 심미적 손상을 통한 환자의 삶의 질을 떨어뜨린다[2,3]. 치료 방 법으로는 수술이나 방사선 치료 및 cisplatin과 같은 항암제 병행요법 등이 있지만 이러한 항암제의 경우 심한 부작용으로 사용에 제한적이므 로, 항암제의 부작용을 최대한 감소시키면서 항암 효과를 유지할 수 있 는 항암제 개발 연구가 진행되고 있다[2-4]. 그중 하나로 합성제보다 비교적 안전성이 인정된 천연추출물을 이용한 항암 연구가 활발하게 진 행되고 있다[5,6].

환삼덩굴(Humulus japonicus)은 다년생 초본으로 대마초과에 속하 는 여러해살이풀이며 우리나라 전역과 동아시아 지역에 주로 분포하고 있다[7,8]. 환삼덩굴의 약명인 율초는 전통적으로 폐결핵, 고혈압, 나 병, 독창 치료를 위해 사용되어왔으며, 중국과 한국에서는 차의 성분으 로 사용되었다[8-11]. 환삼덩굴은 항산화 활성을 통한 항노화, 항균, 항 동맥경화, 항염증 활성과 같은 다양한 생리활성이 보고되어 있으며, 테 르펜, 페놀 및 플라보노이드가 그 유효성분으로 보고되고 있다[12-15]. 또, 환삼덩굴의 아세트산에틸 분획물에서 분리한 3가지의 글루코실 플 라본은 자외선으로 인한 광노화를 매우 효과적으로 억제하였으며, 갈 릭과 수박 추출물 분말과 혼합한 환삼덩굴 열수추출물은 그람양성 박 테리아의 성장을 억제시킴으로써 종방향의 뼈 성장촉진 효과가 보고되 어 있으며, 그람양성 박테리아/d-Galactosamine으로부터 간을 보호 하는 효과가 있다고 보고되어 있다[10,16,17]. 환삼덩굴 잎 메탄올추출 물에서 분리한 두 페놀 성분(methyl ferulate, apigenin-7-O-beta- D-glucopyranoside)은 난소암세포인 SK-OV-3와 대장암세포인 HCT15에서의 세포독성효능이 있는 것으로 보고되어 있으나, 그 기전 과 다른 암세포에서의 항암활성은 보고된 바가 없다[18].

이에 본 연구는 환삼덩굴 메탄올추출물을 이용하여 사람 유래 인두 편평암세포 FaDu에서 항암활성과 그 기전을 규명하여 향후 항암제 개 발을 위한 강력한 후보물질로써 그 이용가능성을 제시하고자 한다.

Materials ans Methods

1. 실험재료

국내산 환삼덩굴은 전라남도 보성의 개인 사유지에서 채취한 것을 제 공받았으며, 실험실에서 메탄올을 추출한 후 동결건조시켜 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 녹여 사용하였다. Live/Dead^TM Viability/Cytotoxicity kit는 Thermo Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입 하여 사용하였으며, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)와 4‘6-diamid-ino-2-phenylindole (DAPI)은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용 하였다. 1차 항체인 cleaved caspase-9 (#52873T), -3 (#9664T), -7 (#8438T), poly(adenosine diphosphate ribose [ADP]- ribose) polymerase (PARP) (#9532S), BCL-2 (#4223S) 및 Bax (#2772S)는 Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA), α-tubulin (#WB320515)은 Invitrogen (Camarillo, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다.

2. 환삼덩굴 메탄올추출물 제조(MeHJ)

환삼덩굴 잎 10 g을 메탄올 200 mL에 24시간 동안 추출하고 여과 지를 이용하여 추출액을 filtering한 뒤 감압 농축하였다. 동결건조 후 분말 추출물을 DMSO에 200 mg/mL로 녹여 syringe filtering한 후 –20℃에 보관하였고, 세포배양액에 희석하여 사용하였다.

3. 세포 배양

사람 인두 편평암세포 FaDu (CCL-17^TM; ATTC, Manassas, VA, USA)는 10% fetal bovine serum (FBS; iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea) 및 항생제(100 U/mL penicillin, 100 U/ mL streptomycin)가 함유된 minimum essential medium (MEM; Welgene, Gyeongsan, Korea)을 사용하여 5% CO₂, 37℃ incubator 조건으로 배양하면서 실험에 사용하였다.

4. 세포 성장률 분석

MeHJ에 대한 FaDu 암세포의 생존율은 MTT 기법을 이용하여 분 석하였다. 12 well 세포 배양 접시에 well당 2 × 10⁵개의 FaDu 암세 포를 접종하여 overnight 배양한 후, 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 mg/mL 의 MeHJ을 세포 배양액에 희석하여 처리한 다음 24시간 동안 반응하 였다. 추출물 반응 후 배양액을 제거하고 phosphate buffered saline (PBS)로 두 번 세정한 후, MEM 배양액 1 mL당 100 μL MTT (5 mg/ mL) 용액을 첨가하여 37℃의 5% CO₂ incubator에서 4시간 반응하 였다. 반응 후, 배양액을 제거하고 DMSO로 formazan염을 녹여내어 ELISA reader (Epoch; BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) 를 사용하여 590 nm 흡광도에서 세포 생존율을 측정하였으며, 시료를 처리하지 않는 대조군의 흡광도를 100%로 하고 시료를 처리한 실험군 의 흡광도를 대조군과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

5. Colony formation 측정

6 well 세포 배양 접시에 well당 2 × 10⁵개의 FaDu 암세포를 접종 하여 overnight 배양한 후, FaDu 암세포에 대한 MeHJ의 non-cytotoxicity 농도인 0.05 mg/mL와 cytotoxicity를 유도하는 가장 낮은 농 도인 0.1 mg/mL을 처리한 다음 24시간 동안 반응하였다. 24시간 후, 2일마다 배양액을 교체하며 4일 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 가볍게 세정한 다음 99% 에탄올을 이용하여 5분간 고정하였 다. 고정 후 말린 다음 0.1% crystal violet 용액을 첨가하여 3분간 염 색하였다. PBS로 염색되지 않은 부분을 세척한 후 Canon PowerShot G16 (Canon, Tokyo, Japan)으로 형성된 colony를 관찰하였다.

6. Live & Dead assay

12 well 세포 배양 접시에 2 × 10⁵개의 FaDu 암세포를 접종하여 overnight 배양한 후, 0.1, 0.2, 0.4 mg/mL의 MeHJ를 처리하여 24 시간 동안 반응하였다. 반응 후, 배양액을 제거하고 1X PBS에 희석 된 live dye (calcein AM, Green)과 dead dye (EthD-1, Red)를 1 μL:3 μL 비율로 혼합한 후, 각 well에 혼합액을 1 mL씩 첨가하여 상 온에서 5분간 염색하였다. 염색한 FaDu 암세포를 형광현미경(Eclipse TE2000; Nikon Instruments, Tokyo, Japan)을 이용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 비교 분석하였다. 각 이미지의 세포를 모두 카운팅 하여 전체 세포에 대한 red 세포 비율을 계산한 뒤 대조군과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

7. DAPI 염색

6 well 세포 배양 접시에 2 × 10⁵개의 FaDu 암세포를 접종하여 overnight 배양한 후, 0.1, 0.2, 0.4 mg/mL의 MeHJ를 처리하고 24 시간 동안 반응하였다. 반응 후, 배양액을 제거하고 1X PBS로 가볍 게 세정하였다. 이후 4% paraformaldehyde를 이용하여 5분간 고정 한 뒤 1X PBS로 다시 한번 세정하였다. Well마다 DAPI (300 nM) 2 μL를 처리하여 5분간 염색하였다. 염색한 FaDu 암세포는 형광현미경 (Eclipse TE2000)을 이용하여 세포사멸이 유도된 세포의 핵형 및 세포 질 형태를 분석하였다. 각 이미지의 세포를 모두 카운팅하여 전체 세포 에 대한 세포사멸 세포 비율을 계산한 뒤 대조군과 비교하여 백분율(%) 로 표시하였다.

8. 유세포 분석

6 well 세포 배양 접시에 well당 2 × 10⁵, 1 × 10⁵개의 FaDu 암세 포를 접종하여 overnight 배양한 후, 0.1, 0.2, 0.4 mg/mL의 MeHJ 를 처리하여 24시간 동안 반응하였다. 부유 세포와 plate에 붙은 세포 를 모두 수확한 뒤, 1X PBS로 두 번 세척하고 1X binding buffer (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 100 μL를 첨가하여 suspension하였다. 400 μL의 1X binding buffer에 Annexin V-FITC와 propidium iodide (PI)가 1:1로 혼합된 혼합액을 추가로 첨가하여 15 분간 세포를 염색하였다. Gallios flow cytometer (Beckman Coulter Life Science, Indianapolis, IN, USA)를 이용하여 10,000개의 세포에 대해 유세포 분석을 수행하였으며, Kaluza analysis software (Beckman Coulter)를 이용하여 apoptosis 각 단계에 있는 세포 수를 측정하였다.

9. 단백 발현 분석

6 well 세포 배양 접시에 well당 각각 2 × 10⁵개의 FaDu 암세포를 접종하여 overnight 배양한 후, 0.1, 0.2, 0.4 mg/mL의 MeHJ를 처 리하여 24시간 동안 반응하였다. 부유세포 및 plate에 붙어있는 세포 를 모두 수확한 뒤, 1X PBS로 두 번 세정한 다음, total protein lysis buffer (iNtRON Biotechnology)를 이용하여 10분마다 voltexing하 며 30분간 반응한 후, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 상등 액을 취하여 얻은 total protein은 Pierce^TMBCA Protein kit (Thermo Scientific)을 이용하여 정량하였다. 20 ㎍ 단백질을 5X sample buffer와 혼합하여 95℃에서 5분간 변성시킨 뒤, 10% 혹은 12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis에서 전기 영동한 후, polyvinylidene fluoride membrane으로 이동시켰다. Membrane은 5% blocking solution (5% bovine serum albumin in tris-buffered saline [TBS] containing 0.1% Tween-20)에서 30분 동안 blocking하고, 1차항체인 cleaved caspase-9, cleavedcaspase- 3, cleaved caspase-7, cleaved PARP, BCL-2, Bax는 1:1,000으로 희석하고, α-tubulin은 1:2,000으로 희석하여 4℃에서 O/N 반응하였다. 이후, TBS-with Tween 20 (TBS-T)로 10분씩 3번 세척한 다음, horseradish peroxidase가 접합된 2차항체로(1:5,000) 1시간 반응한 다음 TBS-T로 10분씩 3번 세척하였다. 결과 분석은 ECL kit (Millpore, Burlington, MA, USA)을 이용하여 MicroChemi 4.2 (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Neve Yamin, Israel)를 통 해 protein band를 가시화하였다.

10. 통계적 유의성

모든 실험성적은 mean ± standard deviation으로 나타내었고, 각 실험군 간의 유의성 검정은 Graphpad prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 이용하여 Tukey t-test를 하였으며, p-value가 0.05 미만(p ＜ 0.05)의 경우에 통계적 유의성이 있는 것으 로 간주하였다.

Results

1. MeHJ에 의해 FaDu 암세포의 성장 억제 및 세포사멸 유도

MeHJ가 구강암세포 FaDu와 정상세포 L929 성장에 미치는 영향을 알아보기 위해 MTT assay를 수행하였다. MeHJ를 0.1, 0.2, 0.4, 0.8 mg/mL로 24시간 동안 처리하였을 때, 농도 의존적으로 FaDu 암세포 의 증식이 억제되었으나, L929 세포 성장에는 영향을 미치지 못하였다 (Fig. 1A and 1B). 이러한 성장 억제 효과가 FaDu 암세포의 무제한 재 생(증식) 능력 또한 억제할 수 있는지를 colony formation 분석을 통해 평가하였다. 세포 독성을 나타내지 않는 0.05 mg/mL과 세포 독성을 나타내는 가장 낮은 농도 0.1 mg/mL을 FaDu 암세포에 24시간 동안 처리한 후, 3일마다 10% FBS가 함유된 정규 배양액으로 교체해주면 서 10일 동안 배양하였다. 이후, crystal violet 염색을 이용하여 형성된 콜로니를 분석한 결과, 대조군과 비교하여 0.1 mg/mL를 처리한 실험 군에서 FaDu 암세포의 콜로니 형성 능력이 현저히 감소하였으며, 0.05 mg/mL에서도 확연한 감소를 확인하였다(Fig. 1C and 1D). MeHJ에 의한 암세포 성장 억제 효과가 세포사멸과 관련이 있는지 확인하기 위 해 live & dead assay 및 DAPI 염색을 수행하였다. Fig. 1E와 1F에서 처럼, 대조군보다 0.1, 0.2 및 0.4 mg/mL의 추출물을 처리한 실험군 에서 농도-의존적으로 살아있는 세포를 나타내는 녹색 형광은 점차 감 소하였으나 죽은 세포를 나타내는 붉은 형광은 점차 많아지는 것을 확 인하였으며(Fig. 1E and 1F), DAPI 염색을 통해 세포사멸이 유도된 세 포의 핵 변화를 분석한 결과, 0.1 mg/mL를 처리한 실험군에서는 대조 군과 큰 차이가 없었으나, 0.2와 0.4 mg/mL을 처리한 실험군에서 세 포질의 위축과 염색질의 응축을 확인하였다(Fig. 1G and 1H).

2. 유세포 분석을 이용한 MeHJ에 의한 FaDu의 세포사멸

MeHJ에 의한 FaDu 암세포의 세포사멸을 정량하기 위해 Annexin- V와 PI를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. 세포 안쪽 막에 위치하 고 있는 phosphatidylserine (PS)은 세포사멸 진행 시 flips 현상을 보 이므로 PS와 강한 친화력을 가지고 있는 Annexin-V를 처리함으로써 세포사멸이 진행되는 세포를 관찰할 수 있다. FaDu 암세포에 MeHJ 를 0.1, 0.2 및 0.4 mg/mL를 24시간 동안 처리한 결과, 전체 세포사 멸 비율이 대조군은 2.2%였던 반면, 0.1, 0.2 및 0.4 mg/mL에서 그 비율이 18.1, 30.1, 32.3%로 추출물의 농도가 증가할수록 세포외막 으로 돌출된 PS와 결합한 Annexin-V-FITC가 증가하는 것을 확인하 였다(Fig. 2A). Fig. 3B는 Annexin-V와 PI 염색이 되지 않는 live 세 포 비율과 세포사멸이 유도된 세포의 비율을 그래프로 나타낸 것으로, MeHJ의 농도가 증가할수록 live 세포는 감소하는 한편 세포사멸이 유 도된 세포는 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 2B). 이러한 결과는 MeHJ 에 의한 FaDu 암세포의 성장 억제 효과가 세포사멸에 매개될 수 있음을 시사한다.

3. MeHJ에 의한 세포사멸 관련 단백질 발현 유도

Caspase는 세포사멸을 수행하는 단백질 효소로, 이들 단백질의 활 성 여부는 세포사멸을 평가하는 데 중요한 지표가 된다. 따라서 MeHJ 에 의한 FaDu 암세포의 세포사멸이 caspase의 활성과 관련되어있는 지 확인하기 위해 cleaved caspase의 발현을 분석하였다. FaDu 암세 포에 MeHJ를 0.1, 0.2 및 0.4 mg/mL를 24시간 동안 처리한 결과, cleaved caspase (-9, -7, -3, PARP) 형태가 증가하였다(Fig. 3A). 또한, 미토콘드리아 막에서 세포사멸을 조절하는 BCL-2 family 단백 발현을 확인한 결과, MeHJ를 처리한 실험군에서 anti-apoptotic 인자 인 BCL-2의 단백 발현이 감소하였으며, pro-apoptotic 인자인 Bax의 단백 발현이 증가됨을 확인하였다(Fig. 3B).

Discussion

본 연구에서는 환삼덩굴 메탄올추출물(MeHJ)의 구강암세포 FaDu 에 대한 세포 성장 억제 효과와 그 기전을 분석하였다. 환삼덩굴은 예로 부터 율초라는 약명으로 오랫동안 사용되어 왔음에도 불구하고, 난소암 세포인 SK-OV-3와 대장암세포인 HCT15에서 세포 독성 효과 외에 다양한 생리활성 및 기전에 대한 과학적인 근거가 매우 부족하다[18]. 따라서 본 연구를 통해 MeHJ의 효과적인 항암 활성 및 그 기전을 분석 하여 차후 항암제 개발을 위한 기능성 천연재료로써 가능성을 제시하고 자 한다.

항암제의 가장 큰 부작용은 암세포뿐만 아니라 정상세포의 성장에도 영향을 미치는 것으로 정상세포의 성장을 억제시킴으로써 다양한 부작 용을 초래한다[19]. 따라서, 정상세포의 성장에는 영향을 미치지 않으 면서 암세포만을 표적하는 항암 물질 발굴이 매우 중요하다. 본 연구에 서 MeHJ은 L929 정상세포의 성장에는 영향을 주지 않으면서 FaDu 암세포의 성장은 농도-의존적으로 유의미하게 억제함을 확인하였으 며, 암세포의 재생 능력 및 콜로니 군집 형성능을 분석한 결과, 세포 독 성을 유발하지 않는 농도임에도 불구하고 대조군에 비해 콜로니 형성이 완전히 억제됨을 확인하였다. 이러한 결과는 간암세포(HepG2)에 대한 MeHJ의 성장억제 효과와 일치하는 것으로, Lee 등[9]은 다른 암세포 (HCT-116, A549, AGS)에서는 세포 독성 효과가 없었으나 0.5 mg/ mL에서 간암세포(HepG2) 성장만을 50% 억제하였다고 보고하였다.

암세포의 세포사멸 유도는 암세포의 무제한 증식을 억제하기 위한 효 과적인 전략으로, 대부분의 항암제들이 이러한 기전을 기반으로 하고 있다[20,21]. MeHJ에 의한 FaDu 암세포의 성장억제 효과가 세포사 멸에 의한 것인지 알아보기 위해 DAPI 염색을 수행한 결과, MeHJ가 처리된 군에서 핵 및 세포질의 응축, 염색질의 분절화 등이 관찰되었으 며, 이를 유세포 분석을 통해 분석한 결과, MeHJ가 초기 세포사멸단 계를 지나 말기 세포사멸단계까지 빠르게 유도되는 것을 확인할 수 있 었다. 이러한 결과는 MeHJ에 의한 FaDu 암세포의 성장 억제가 세포 사멸 기전을 통해 매개될 수 있음을 증명한 것으로, 세포사멸 기전 분석 을 위해 caspase 신호전달체계를 분석하였다. Caspase들의 활성은 death-receptor의 리간드 결합을 통한 외인성 경로뿐만 아니라 미토 콘리아에 의한 내인성 신호전달과도 밀접하게 관련되어 있어, 세포생존 에 필요한 요소들을 결핍시킴으로써 세포사멸을 유도하는 것으로 알려 져 있다[22]. MeHJ을 처리한 군에서 caspase-9, -3, -7 및 PARP의 절단이 유도되었으며, 항세포사멸인자인 BCL-2의 발현 감소 및 세포 사멸 인자인 Bax의 발현 증가를 확인하였다. 이러한 결과는 다른 천연 자원 추출물들의 항암효과 및 기전과 일치하는 것으로, 님나무 추출물 은 유방암에 대한 성장 억제 및 내성 저항성 효능이 있으며, 지치뿌리에 서 분리한 acetylshikonin은 대장암세포(HCT-15, LoVo)의 reactive oxygen species 레벨을 상승시킴으로써 세포사멸을 유도한다고 보 고되어 있다[23,24]. 또, 메타세콰이아 교목의 유기용매(chloroform, ethyl acetate, n-hexane, dichloromethane) 추출물은 자궁경부암 세포(HeLa, COS-7)의 세포주기를 arrest 시키면서 내인성 세포사멸 기전을 통해 세포사멸을 유도한다고 보고되어 있다[25]. 그러나, 항암 제 개발을 위한 기능성 소재로써 이용하기 위해서는 다양한 암세포의 성장 억제 효과와 기전이 규명되어야 할 것으로 생각한다.

결론적으로, 본 연구에서는 MeHJ에 의한 사람 인두 편평암세포 FaDu의 성장 억제가 caspase- 및 미토콘드리아-신호전달체계를 통 한 세포사멸에 의해 매개될 수 있음을 시사한다.