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ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)

International Journal of Oral Biology Vol.47 No.3 pp.33-40
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2022.47.3.33

Regulatory mechanisms of the store-operated Ca²⁺ entry through Orai1 and STIM1 by an adaptor protein in non-excitable cells

Jung Yun Kang¹, Yu-Mi Yang²*

¹Department of Dental Hygiene, College of Software Digital Healthcare Convergence, Yonsei University, Wonju 26493, Republic of Korea
²Department of Oral Biology, Yonsei University College of Dentistry, Seoul 03722, Republic of Korea

^*Correspondence to: Yu-Mi Yang, E-mail: ymyang@yuhs.ac https://orcid.org/0000-0002-6228-9044

Received September 13, 2022 Review September 17, 2022 Accepted September 19, 2022

Abstract

Store-operated Ca²⁺ entry (SOCE) represents one of the major Ca²⁺ entry routes in non-excitable cells. It is involved in a variety of fundamental biological processes and the maintenance of Ca²⁺ homeostasis. The Ca²⁺ releaseactivated Ca²⁺ (CRAC) channel consists of stromal interaction molecule and Orai; however, the role and action of Homer proteins as an adaptor protein to SOCE-mediated Ca²⁺ signaling through the activation of CRAC channels in non-excitable cells still remain unknown. In the present study, we investigated the role of Homer2 in the process of Ca²⁺ signaling induced by the interaction between CRACs and Homer2 proteins in non-excitable cells. The response to Ca²⁺ entry by thapsigargin-mediated Ca²⁺ store depletion remarkably decreased in pancreatic acinar cells of Homer2^–/– mice, as compared to wild-type cells. It also showed critical differences in regulated patterns by the specific blockers of SOCE in pancreatic acinar cells of Homer2^–/– mice. The response to Ca²⁺ entry by the depletion in Ca²⁺ store markedly increased in the cellular overexpression of Orai1 and STIM1 as compared to the overexpression of Homer2 in cells; however, this response was remarkably inhibited by the overexpression of Orai1, STIM1, and Homer2. These results suggest that Homer2 has a critical role in the regulatory action of SOCE activity and the interactions between CRAC channels.

Key Words : Calcium signaling , Ion channel gating , Orai1 protein , Stromal interaction molecule 1

초록

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This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/bync/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

Introduction

세포 내 칼슘 이온은 이차 전령체로서 유전자 발현, 세포의 성장, 분화 및 사멸과 같은 기초 생물학적 활동에 중요한 역할을 담당한다. 세포 내 칼슘 농도([Ca²⁺]_i)의 증가는 크게 세포질 그물망(endoplasmic reticulum, ER) 또는 근육세포질 그물망(sarcoplasmic reticulum) 내에 저 장된 칼슘의 방출과 형질막(plasma membrane)을 통한 세포외 칼슘 유입의 두 가지로 나뉜다. Store-operated Ca²⁺ entry (SOCE)는 세 포내 칼슘 저장고인 ER의 칼슘 고갈에 의한 신호 유발과 형질막에 있는 칼슘 채널의 열림에 의해 세포 내부로 칼슘이 유입되는 두 과정이 결합 되어 세포 내 칼슘 신호를 생성하는 기전으로 세포의 칼슘 신호 전달 및 세포 내 칼슘 조절과 저장 등의 항상성 유지 기능을 세포 전반에서 수행 한다[1,2]. SOCE를 매개하는 Ca²⁺ release-activated Ca²⁺ (CRAC) 채널은 Orai 채널과 transient receptor potential canonical (TRPC) 채널 및 이 두 채널의 개폐에 관여하는 ER 칼슘 센서인 stromal interaction molecule 1 (STIM1)으로 구성된다[3-7]. 세포내 칼슘 저장고 가 고갈되면 STIM1의 STIM1 Orai1-activating region (SOAR) 영역 이 Orai1에 결합하여 Orai1 채널의 열림을 촉진하고, STIM1의 SOAR 영역이 TRPC 채널에도 직접 결합하여 TRPC 채널들과 정전기적 상호 작용(electrostatic interaction)에 의해 채널의 열림을 활성화시킨다 고 알려져 있다[7,8]. STIM1은 SOAR 영역을 통해 Ca_v1.2 채널과 결 합하여 Ca_v1.2 채널의 열림을 강하게 억제시켜 Orai 채널의 활성을 유 도하고[9], 칼슘 저장고 고갈에 의한 STIM1과 Ca_v1.2 채널의 상호 작 용을 어댑터 단백(adaptor protein)인 Homer1이 도움을 준다고 보 고된 바 있다[10]. 또한, inositol 1,4,5-triphosphate (IP₃) 수용체 (IP₃Rs)도 TRPC 채널들과 결합하여 활성을 조절하는데[11], 이 과정에 서 Homer1이 조절작용을 돕는다[12].

어댑터 단백 중의 하나인 Homer 단백은 Homer1, Homer2, Homer3로 분류된다. Homer 단백들은 N-말단에 Ena/VASP homology 1 (EVH1) 단백 결합 도메인이 존재하며, 이 도메인은 칼슘 을 조절하는 phospholipase C (PLC), IP₃ 수용체들, ryanodine 수용 체들(RyRs) 및 Orai 채널, TRPC 채널들과 칼슘 채널들 같은 단백들 에 존재하는 PPXXF나 LPSSP가 포함된 리간드와 결합할 수 있는 곳으 로 알려져 있다[10,12-14]. 이러한 Homer 단백은 신경 세포에서 시 냅스 활성을 조절하는 시냅스 단백으로 처음 알려졌으며[13,15], 이후 연구들을 통해 세 가지의 Homer 단백들이 칼슘 신호 전달기전에서 서 로 다른 역할을 수행하는 것으로 보고되었다. Homer1은 TRPC 채널 과 IP₃ 수용체들의 결합 및 CRAC 채널인 Orai 채널과 STIM1의 결합 을 도와 칼슘 유입을 조절한다[12,14,16]. Homer2는 췌장의 선세포 에서 RGS (regulator of G-protein signaling) 단백과 PLC의 GAP (GTPase-activating protein) 활성 조절을 통해 GPCR (G proteincoupled receptor)들의 칼슘 신호 유발 자극에 대한 강도를 조절하며, Homer2 단백과 CRAC 채널들 간의 상호 작용을 통해 세포 내 칼슘 신 호를 조절 가능하게 한다[17,18]. 또한, 이하선 선세포에서 Homer2는 plasma membrane Ca²⁺-ATPase (PMCA)와 결합하여 [Ca²⁺]_i를 조 절하고, 아밀라아제 분비와 관련한 칼슘 신호 유발 자극의 강도를 조절 한다[19,20]. 근세포 분화과정 동안 Homer1과 Homer2는 RyR을 통 한 칼슘 분비 증가에 의해 nuclear factor of activated T cells type c1 (NFATc1)-의존성 신호기전을 활성화하고[21], T 림프구와 파골세 포에서 Homer2와 Homer3는 calcineurin과 경쟁적으로 NFAT에 결 합하여 T 세포의 활성 및 파골세포 분화 조절에 관여한다는 것이 밝혀 졌다[22-24]. 이렇게 다양한 연구 결과에도 불구하고, 비흥분성 세포에 서 CRAC 채널들의 활성을 통해 발생하는 칼슘 신호에서의 Homer 단 백의 역할과 기능에 대해서는 여전히 명확히 알려져 있지 않다. 본 연구 에서는 Homer2 유전자 제거(Homer2 ^–/–) 마우스 및 Homer2 DNA 를 이용하여 비흥분성 세포에서 SOCE를 매개하는 CRAC 채널들과 Homer2의 상호 조절작용을 통해 유도되는 칼슘 신호 조절기전에서 Homer2의 역할을 알아보고자 하였다.

Materials and Methods

1. 재료

Fura-2-acetoxymethyl ester (Fura-2/AM)는 Molecular Probes (Eugene, OR, USA)에서 bovine serum albumin (BSA) 와 pyruvic acid는 Amresco (Solon, OH, USA)에서 구입하였으며, thapsigargin (Tg)은 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY, USA) 에서 구입하였다. 2-Aminoethoxydiphenyl borate (2APB)는 Tocris Bioscience (Bristol, UK)에서 구입하였으며, Collagenase type IV, soybean trypsin inhibitor, N-[2-hydroxyethyl] piperazine-N’ -[2-ethanesulfonic acid] (HEPES), gadolinium (Gd³⁺) chloride, lanthanum (La³⁺) chloride, D-glucose 및 그 외 시약들은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

2. 실험동물

대조군(wild-type, WT)과 Homer2^–/– 마우스는 선행 연구에서 제 작/사용되었던 실험동물(25–28 g)을 사용하였으며[18-20], 모든 실험 동물들은 연세대학교 치과대학 동물실에서 12시간 주/야 순환 주기와 일정한 온도, 습도를 유지하면서 사료와 물을 자유로이 공급하며 사육 되었다. 모든 실험은 연세대학교 실험동물 윤리위원회(IACUC 승인 번 호 2010-0211)의 윤리규정에 따라 진행하였다.

3. 췌장의 선세포 분리

췌장의 선세포 분리는 콜라게네이즈 분해법(collagenase digestion) 을 이용하여 선행연구에서 사용된 방법을 응용하여 실시하였다 [18-20]. 분리된 세포는 생리식염수(140 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 10 mM HEPES, 10 mM glucose, 310 mOsm, pH 7.4 with NaOH)에 0.1% BSA와 0.02% soybean trypsin inhibitor를 첨가한 solution A에 담근 후 사용할 때까지 얼음 에 보관하였다.

4. 세포 배양 및 플라즈미드 DNA 형질 주입(transfection)

HEK293 세포(Korean Cell Line Bank, Korea)는 10% fetal bovine serum (Invitrogen, Waltham, MA, USA)과 100 units/mL penicillin/streptomycin이 들어간 세포 배양액(Dulbecco’s modified Eagle’s medium, Invitrogen)을 사용하여 5% CO₂ 상태를 유 지하며 세포 배양기에서 배양되었다. 배양된 HEK293 세포는 1–5 × 10⁵ 정도의 세포를 35-mm 세포 배양 접시에 커버슬립을 넣은 후 항 생제가 들어가지 않은 배양액과 함께 넣어 준비하였다. 다음 날, 플라 즈미드 DNA는 형질 주입을 위한 화합물질(transfection reagent)인 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)과 Opti-MEM을 매뉴얼에 따라 혼 합하여 상온에서 20분간 유지한 후 세포 배양액을 첨가하여 형질 주입 38–48시간이 지난 후 실험에 사용하였다.

5. [Ca²⁺]_i 측정

[Ca²⁺]_i의 변화를 측정하기 위하여 대조군과 Homer2^–/– 마우스에서 분리한 췌장 선세포는 생리식염수에서 5 μM Fura-2/AM과 0.05% pluronic F-127를 60분간 처리하였다. Fura-2의 형광은 Molecular Devices (Downingtown, PA, USA) 이미징 시스템을 이용하였으며, 이때 파장은 excitation 파장(340 nm와 380 nm)과 emission 파장 (510 nm)을 사용하여 형광의 변화를 측정하였다(Ratio = F₃₄₀/F₃₈₀). Fura-2의 형광 변화 이미지들은 도립 현미경(inverted microscope, Nikon Instruments Inc., Tokyo, Japan)에 부착된 CCD 카메라 (Photometrics, Tucson, AZ, USA)를 통하여 컴퓨터에서 2초 간격으 로 기록하였다. 모든 실험자료의 분석은 MetaFluor software (Molecular Devices)를 이용하였다.

6. 실험자료의 통계 분석

모든 실험자료의 수치 값은 평균값 ± 표준오차(mean ± S.E.)로 표 시하였다. 각 수치 값의 통계적 유의성 검증은 독립 t-test를 시행하였 으며, p ＜ 0.05에서 통계적으로 유의하다고 평가하였다.

Results

1. 췌장 선세포에서 Homer2에 의한 SOCE 변화 양상

이전 연구들에서 Homer2 유전자의 결여는 칼슘 신호 관련 단백들 과 채널들의 발현 및 이들을 통한 칼슘 신호의 변화를 유발하였다[17- 20]. 이에 외부 칼슘이 없는 환경의 대조군(WT)과 Homer2^–/– 마우스 의 췌장 선세포에서 2 μM Tg 자극에 의해 저장고 칼슘을 고갈시켜 세 포질로 나오는 [Ca²⁺]_i과 2 mM 외부 칼슘 자극에 의해 세포 내로 유입 되는 [Ca²⁺]_i을 측정하였다. 그 결과, 대조군과 Homer2^–/– 선세포에서 SOCE 활성에 의해 유입된 칼슘 반응은 대조군보다 확연히 증가되었으 나(WT 0.046 ± 0.003 vs. Homer2^–/– 0.128 ± 0.008, 2.78배 증 가), 2 mM 외부 칼슘 자극에 의한 [Ca²⁺]_i 증가 효과는 대조군과 비교 해 유의하게 줄어든 것(WT 0.191 ± 0.012 vs. Homer2^–/– 0.145 ± 0.007, 24.08% 감소)을 확인하였다(Fig. 1). 이러한 결과는 Homer2 단백의 발현이 SOCE 활성에 의한 [Ca²⁺]_i의 조절에 관여하는 CRAC 채 널들과 밀접한 연관성이 있음을 나타낸다.

다음으로 SOCE 활성을 통한 칼슘 유입을 억제하는 것으로 알려 진 억제제들을 사용하여 세포 내로 유입되는 칼슘의 변화를 조사하였 다. 2 mM 외부 칼슘 자극과 함께 IP₃ 수용체와 SOCE 활성을 통한 칼 슘 유입 작용을 저해하는 것으로 알려진 2APB를 처리한 후 [Ca²⁺]_i를 측정한 결과, 대조군과 Homer2^–/– 선세포에서의 [Ca²⁺]_i 증가 반응은 Fig. 1B의 결과와 비교하여 2APB에 의한 억제 효과를 유의하게 나타 냈으며(WT 49.74% 감소; Homer2^–/– 73.79% 감소), 대조군에 비 해 Homer2^–/– 선세포에서 칼슘 유입이 확연히 줄어든 것으로 나타났 다(Fig. 2A and 2D). 반면, 비특이적 SOCE 활성을 통한 칼슘 유입 및 CRAC 채널의 억제제인 Gd³⁺을 처리한 후, Homer2^–/– 선세포에서의 외부 칼슘 자극에 의한 [Ca²⁺]_i 증가는 대조군에 비해 Gd³⁺에 의한 칼슘 유입 억제 영향을 받지 않았음(WT 73.82% 감소; Homer2^–/– 8.97% 감소)을 확인하였다(Fig. 2B and 2D). 또한, Gd³⁺와 유사하게 비특이 적 SOCE 활성을 통한 칼슘 유입과 CRAC 채널의 억제 및 칼슘 채널 저해제인 La³⁺을 처리한 후 [Ca²⁺]_i를 측정한 결과, 대조군의 췌장 선세 포에서는 [Ca²⁺]_i 유입이 현저히 감소된 반면, Homer2^–/– 세포에서는 La³⁺에 의한 칼슘 유입 억제 영향을 거의 받지 않았음(WT 84.82% 감 소; Homer2^–/– 37.24% 감소)을 확인하였다(Fig. 2C and 2D). 이러한 결과들은 SOCE 활성에 의한 [Ca²⁺]_i의 조절에 관여하는 CRAC 채널들 과 칼슘 채널 간의 활성 조절과 Homer2 발현 정도와의 긴밀한 상관성 이 있음을 시사한다.

2. Homer2에 의한 CRAC 채널의 활성과 SOCE 반응의 조절

Homer2 단백 발현 조절에 따른 SOCE 활성을 통한 칼슘 유입 조절 에 대한 영향을 조사하기 위해, HEK293 세포에 Homer2 DNA를 형질 주입 방법으로 세포 내 과발현시킨 후 대조군 HEK293 세포(Empty) 와 함께 SOCE 반응 조절에 대한 영향을 조사하였다. 외부 칼슘이 없 는 환경에서 2 μM Tg 자극에 의해 ER의 칼슘 고갈 후 증가된 [Ca²⁺]_i 의 크기는 대조군에 비해 Homer2 과발현 세포(H2)에서 유의하게 증가 된 것을 확인하였다(Empty 0.044 ± 0.007 vs. H2 0.068 ± 0.004, 1.55배 증가). 이후 2 mM 외부 칼슘 자극에 의해 세포 내로 유입되는 [Ca²⁺]_i 을 측정한 결과, Homer2 과발현 세포에서 세포 내로 유입된 [Ca²⁺]_i 크 기가 대조군 세포에 비해 소량 줄어든(Empty 0.164 ± 0.004 vs. H2 0.152 ± 0.004, 7.32% 감소) 것을 확인하였다(Fig. 3A–3C). 또한, 대조군 HEK293 세포와 Homer2 과발현 세포에서 외부 칼슘 자극에 의해 세포 내로 유입된 [Ca²⁺]_i은 Fig. 3C의 결과와 비교하여 Gd³⁺에 의 한 SOCE 및 CRAC 채널의 억제작용을 유의하게 받지 않았음(Empty 52.44% 감소; H2 39.47% 감소)을 확인하였다(Fig. 3A, 3B, and 3D).

CRAC 채널에 의한 SOCE 반응 조절 작용에서 Homer2의 영향을 확인하기 위해 HEK293 세포에 CRAC 채널인 Orai1과 STIM1 DNA 를 형질 주입 방법을 이용해 Homer2 DNA와 함께 과발현시킨 후 2 mM 외부 칼슘 자극에 의한 [Ca²⁺]_i 증가 효과 및 Gd³⁺에 의한 [Ca²⁺]_i 증 가 억제 정도를 비교하였다. Orai1과 STIM1 과발현 세포(O1 + S1) 와 Orai1, STIM1 및 Homer2 과발현 세포(H2 + O1 + S1) 모두에서 SOCE 활성을 통한 세포 내 [Ca²⁺]_i 증가는 Homer2 과발현 세포와 비 교해 현저히 증가되는 것(O1 + S1 2.81배 증가; H2 + O1 + S1 2.13 배 증가)을 확인하였으며, 이러한 SOCE 활성에 의한 [Ca²⁺]_i 증가 반응 은 Gd³⁺ 처리에 의해 완벽하게 억제되는 것(O1 + S1 85.48% 감소; H2 + O1 + S1 80.50% 감소)을 확인하였다(Fig. 4). 이러한 결과들을 통해 CRAC 채널들의 과발현은 SOCE 활성 반응에 의한 [Ca²⁺]_i의 유입 을 급격히 촉진시키고, Homer2 발현에 의해 제한적으로 억제 조절 작 용이 활성화될 가능성이 있음을 보여준다.

Discussion

본 연구는 췌장 선세포와 HEK293 세포에서 Homer2의 발현 조절 을 통해 칼슘 저장고의 고갈에 의한 SOCE 활성 시 세포 내로 유입되 는 [Ca²⁺]_i이 조절되며, 다양한 SOCE 억제제들을 사용하여 Homer2가 CRAC 채널들과 상호작용하여 SOCE를 조절할 가능성이 있음을 간접 적으로 제시하였다.

이전의 연구들은 SOCE와 CRAC 채널의 활성 시 신호 조절자로 서 Homer1의 역할 및 작용 기전 규명에 대한 연구가 주를 이루었다. EVH1 도메인의 PPXXF 모티브를 지닌 TRPC 채널들(특히, TRPC1) 과 IP₃ 수용체들 사이의 물리적 연결은 어댑터 단백인 Homer 단백들에 의해 촉진되어 TRPC1-Homer-IP₃ 수용체 복합체를 이루며, TRPC1 채널이 활성화되어 열리면 이 결합은 해제되고 [Ca²⁺]_i 증가 반응이 나 타난다[12]. 또한, 사람의 혈소판 세포에서 [Ca²⁺]_i 조절 시 TRPC1과 IP₃R2의 EVH1 도메인을 통해 Homer1과 직접 결합하여 TRPC1- Homer1-IP₃R2 복합체를 형성한 후 자극에 의해 [Ca²⁺]_i를 증가시키 지만 STIM1의 EVH1 도메인에 결합한 Homer1과 간접적으로 결합한 Orai1이 복합체를 형성하여 SOCE 활성을 통해 [Ca²⁺]_i를 증가시키며, 이때 Homer1은 초기 칼슘 유입 반응보다 이후 반응을 지속시키는 역 할을 담당한다고 보고되었다[14]. 이와 비슷하게 혈관 평활근 세포에서 SOCE 활성 자극을 통한 [Ca²⁺]_i 증가 반응은 Homer1이나 STIM1의 활성 억제에 의해 감소되며, 이 과정에서 형성되는 Orai1-Homer1- TRPC 채널들의 복합체는 Homer1과 STIM1의 EVH1 도메인에 직접 결합한 이후 Homer1과 Orai1이 간접적으로 결합을 이루며 SOCE 반 응을 활성화시킨다[16]. 그러나, Ca_v1.2-Homer1-STIM1 복합체에 서 Homer1의 활성을 억제하면 칼슘 저장고 고갈에 의한 SOCE 자극 시 STIM1과 결합한 Ca_v1.2를 통해 [Ca²⁺]_i이 증가된다[10]는 보고 및 HT-22 신경세포에서 Homer1a-STIM1 복합체는 SOCE 활성 자극에 대한 [Ca²⁺]_i 증가 반응을 감소시키고, Homer1의 활성 억제를 통해 이 러한 억제 반응이 사라진다[25]는 보고도 있다. 이처럼 Homer 단백과 복합체를 구성하는 CRAC 채널들의 종류와 세포 종류에 따라 Homer 단백의 역할은 달라진다. 본 연구진도 이전 연구들을 통해서 다양한 세 포에서 Homer2 단백의 다양한 조절 작용을 보고하였다. Homer1a 는 PMCA의 PDZ (PSD-95/Dlg/ZO-1 domain) 도메인에 결합하여 PMCA 발현 증가 및 세포 내 칼슘 제거에 대한 속도 향상을 보이는 반 면 Homer2 단백은 PMCA의 PPXXF 유사 모티브 결합해 이러한 반응 들을 억제하였고[19], Homer2가 생리학적 농도의 자극에 의해 발생된 칼슘 진동(oscillations)의 진폭(amplitude) 조절을 통해 타액 분비 기 능을 조절하며[20], TRPC3, TRPC6와 Orai1의 발현을 조절하여 수용 체 활성조절을 통한 세포 내 칼슘 유입을 조절할 수 있음을 확인하였다 [18].

SOCE를 통한 세포 내 칼슘 조절은 세포의 다양한 기능 수행 및 세포 의 분화, 성장과 사멸 조절과 밀접한 관련이 있다. 따라서, SOCE 조절 이상이 발생할 경우 심각한 질환들을 초래할 수 있다. 특히, SOCE 신 호 기전에서 주요 인자로 알려진 STIM1은 CRAC 채널인 Orai 채널과 SOC 채널인 TRPC 채널과의 결합을 통해 칼슘 신호를 조절할 뿐만 아 니라, Ca_v1.2나 Ca_v1.3와 같은 L-type 전압개폐(voltage-gated) 칼 슘 채널이나 AMPA 수용체와 NMDA 수용체 같은 수용체/리간드 활 성(receptor/ligand-activated) 칼슘 채널들도 STIM1과 SOCE을 조 절한다[26-28]. Homer 단백들도 이러한 CRAC/SOC 채널들과의 결 합을 통해 SOCE 신호 기전을 조절하는데, 이때 STIM1의 PPXXF 모 티와 Homer 단백의 결합이 이루어졌을 경우에만 정상적인 칼슘 조절 기능을 수행한다고 보고되었다[10,14,16,25]. SOCE와 관련 CRAC/ SOC 채널들에 대한 연구를 위해 다양한 억제제들을 사용한다. 2APB 는 Orai1-STIM1 복합체의 발현 증가로 SOCE 활성이 되었을 때나 dimer 상태의 STIM1이 아닌 STIM1의 SOAR와 coiled-coil 1 부위의 결합 강화에 의한 multimerization 형성에 의한 SOCE 작용 활성 상태 일 때, 그리고 STIM1과의 결합이 활성화된 Orai1을 억제하여 SOCE 활성을 억제한다[29,30]. 그러나, Orai1과 Orai3의 활성에 의한 칼슘 유입 증가 현상에 대해서는 억제 작용을 보이지 않는다고 알려져 있다 [31]. 또한, lanthanide 계열의 Gd³⁺와 La³⁺는 농도에 따라 Orai1의 활 성을 직접적으로 억제하거나, 전압개폐 칼슘 채널과 TRP 채널들의 활 성을 억제할 수 있다고 알려져 있다[30,32]. 따라서, 이러한 억제제들을 사용한 본 실험의 결과는 Homer2가 Orai1/STIM1 복합체의 활성을 조절하며, 췌장 선세포에 발현된 TRP 채널들과 L-type 전압개폐 칼슘 채널들과의 상호작용을 통해 SOCE 신호 기전을 조절할 가능성이 있음 을 제시하였다. 본 논문은 비흥분성 분비 세포에서 Homer2 단백이 ER 칼슘 고갈에 의한 SOCE 활성 시 Orai/STIM1 복합체의 활성을 직접적 으로 조절하며, 이 외 SOC 채널 활성의 간접적 조절을 통해 다양한 칼 슘 신호전달 패턴을 보여준다. 이러한 연구결과는 분비 조직에서 세포 내 칼슘 조절 이상으로 발생되는 체액의 분비 이상이나 염증성 질환 등 의 병리 원인과 기전 규명 관련 연구에 큰 도움이 될 것으로 생각한다.

Acknowledgements

이 논문은 정부(과학기술정보통신부)의 재원으로 한국연구재단의 지 원을 받아 수행된 연구임(NRF-2015R1D1A1A01057277; NRF- 2020R1A2C1004942; NRF-2022R1G1A1004843).

Figure

Fig. 1.

The effect of thapsigargin (Tg)-activated store-operated Ca²⁺ entry (SOCE) in pancreatic acinar cells from wild-type (WT) and Homer2^–/– mice. (A) Application of 2 μM Tg increased a [Ca²⁺]_i in Ca²⁺-free environments (initial Ca²⁺ peak, WT 0.046 ± 0.003, n = 125; Homer2^–/– 0.128 ± 0.008, n = 125) and changes of the Ca²⁺ entry by 2 mM Ca²⁺ (Ca²⁺ entry, WT 0.191 ± 0.012; Homer2^–/– 0.145 ± 0.007) were significant in pancreatic acinar cells between WT and Homer2^–/– mice. (B) The bar graph was presented the magnitude of Ca²⁺ entry by the stimulation of 2 μM Tg and 2 mM Ca²⁺ between WT and Homer2^–/– mice. Data are presented as mean ± S.E.

^*^*p < 0.01 and ^*^*^*p < 0.001 compared to the Ca²⁺ entry in WT cells.

Fig. 2.

Inhibitory effects of various blockers for thapsigargin (Tg)-activated store-operated Ca²⁺ entry (SOCE) in pancreatic acinar cells from wild-type (WT) and Homer2^–/– mice. (A) 50 μM 2-Aminoethoxydiphenyl borate (2ABP) as an IP₃ receptor antagonist and SOCE inhibitor, was partially inhibited for the Ca²⁺ entry between WT and Homer2^–/– mice (WT 0.096 ± 0.005, n = 96; Homer2^–/– 0.038 ± 0.004, n = 20). (B) Low concentrations (1–5 μM) of gadolinium (Gd³⁺) has been commonly used to block SOCE. 5 μM Gd³⁺ was significantly remained the Ca²⁺ entry without the reduction of [Ca²⁺]_i in Homer2^–/– pancreatic acinar cells as a compared to WT cells (WT 0.050 ± 0.004, n = 52; Homer2^–/– 0.132 ± 0.011, n = 36). (C) Lanthanum (La³⁺) is also a potent TRPC blocker and a SOCE inhibitor, however high concentrations (> 100 μM) of La³⁺ has act to inhibit both the entry and efflux of Ca²⁺ ions by blocking of PMCA activities. 100 μM La³⁺ was completely inhibited the Ca²⁺ entry in pancreatic acinar cells from WT mice but not in Homer2^–/– cells (WT 0.029 ± 0.002, n = 63; Homer2^–/– 0.091 ± 0.010, n = 24). (D) The bar graph was presented the magnitude of Ca²⁺ entry by the stimulation of various blockers between WT and Homer2^–/– mice. Data are presented as mean ± S.E.

IP₃, inositol 1,4,5-triphosphate; TRPC, transient receptor potential canonical; PMCA, plasma membrane Ca²⁺-ATPase.

#p < 0.001 and ^&p < 0.001 compared to the Ca²⁺ entry by the stimulation of 2 mM Ca²⁺ in WT and Homer2^–/– cells. ^*^*^*p < 0.001 compared to the Ca²⁺ entry in WT and Homer2^–/– cells.

Fig. 3.

Effects of expressed the Homer2 (H2) cDNA to thapsigargin (Tg)-induced store-operated Ca²⁺ entry (SOCE) in HEK293 cells (Empty). (A and B) Application of 2 μM Tg increased a [Ca²⁺]_i in Ca²⁺-free environments (initial Ca²⁺ peak, Empty 0.044 ± 0.007, n = 152; H2 0.068 ± 0.004, n = 321) and changes of the Ca²⁺ entry by 2 mM Ca²⁺ (Ca²⁺ entry, Empty 0.164 ± 0.004; H2 0.152 ± 0.004) were still remained by 5 μM gadolinium (Gd³⁺) in HEK293 cells and transfected H2 cells (Empty 0.078 ± 0.002, n = 161; H2 0.092 ± 0.002, n = 250). (C and D) Bar graphs were presented the magnitude of Ca²⁺ entry by the stimulation of 2 μM Tg, 2 mM Ca²⁺, and 5 μM Gd³⁺ in 2 mM Ca²⁺ between HEK293 and H2 cells. Data are presented as mean ± S.E.

^*p < 0.05 and ^*^*^*p < 0.001 compared to the Ca²⁺ entry in HEK293 cells.

Fig. 4.

The inhibitory effect of gadolinium (Gd³⁺) for thapsigargin (Tg)-activated store-operated Ca²⁺ entry (SOCE) in expressed Orai1, Stim1, and Homer2 cDNA cells. (A) Increases of the Ca²⁺ entry by 2 mM Ca²⁺ (2 mM Ca²⁺, 0.427 ± 0.005, n = 271) was significantly reduced by 5 μM Gd³⁺ (5 μM Gd³⁺, 0.062 ± 0.007, n = 59) in transfected Orai1 and Stim1 cells (O1 + S1). (B) Changes of the Ca²⁺ entry by 2 mM Ca²⁺ in transfected Orai1, Stim1, and Homer2 cells (H2 + O1 + S1, 2 mM Ca²⁺, 0.323 ± 0.005, n = 464) was smaller than O1 + S1 cells, however the inhibitory effect by 5 μM Gd³⁺ (5 μM Gd³⁺, 0.063 ± 0.002, n = 192) was similarly reduced as a compared to O1 + S1 cells. (C) The bar graph was presented the magnitude of Ca²⁺ entry by the stimulation of 2 mM Ca²⁺ and 5 μM Gd³⁺ between transfected O1 + S1 and H2 + O1 + S1 cells. Data are presented as mean ± S.E.

^#p < 0.001 compared to the Ca²⁺ entry by the stimulation of 2 mM Ca²⁺ in transfected H2 cells. ^*^*^*p < 0.001 compared to the Ca²⁺ entry in transfected O1 + S1 and H2 + O1 + S1 cells.

Table

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