Introduction

구강암(oral cancer)은 입술, 혀, 치주, 하인두 등 구강악안면 부위에 발병하는 암을 통칭하며, 전 세계적으로 매년 100,000명당 1.5명이 새 롭게 진단받으며 1.8명이 사망하는, 전 세계적으로 가장 흔한 암 유형 중 6번째이다[1,2]. 구강암의 90%를 차지하는 구강편평세포암종(oral squamous cell carcinoma, OSCC)은 구강 상피세포에 존재하는 매 우 공격적인 신생물로, 타고난 전이능력 및 증식으로 인해 최근 상당한 진단 및 치료요법이 발전되어 왔음에도 불구하고 5년 생존율이 약 50% 에 머물고 있다[1,3,4]. 일반적으로 화학 요법, 방사선 요법, 수술 또는 이러한 요법을 병행하여 치료하고 있으나, 소화관과 인두 점막에 심한 염증과 궤양을 일으키며 생리적 기능장애, 메스꺼움, 구토를 동반하는 등의 부작용으로 사용에 제한을 받고 있다[2,5,6]. 따라서 OSCC 진행 의 메커니즘을 이해하고 발병의 진행을 지연시키거나 효과적으로 치료 할 수 있는 물질을 식별하는 것이 매우 중요하다.

세포사멸(apoptosis)은 1972년 Kerr 등[7]이 처음으로 논문에 사용 하였으며 현재까지도 이들의 세포사멸에 대한 개념과 현상이 인용되고 있다[7-9]. 세포사멸은 유전학적으로 조절되는 세포사의 한 형태를 의 미하며, 조직 내 일정한 세포수 유지 및 항상성을 위해 면역반응 혹은 방어 기전으로 발생한다[9,10]. 그러나 세포증식과 세포사멸의 불균형 은 세포의 비정상적인 축적을 초래함으로써 여러 질병을 야기하는데, 세포사멸이 불충분할 경우 암과 같은 비정상적인 세포증식에 의한 질환 이 발생하며, 세포사멸이 과도할 경우 알츠하이머와 같은 퇴행성질환 이 발생한다[9]. 따라서, 세포사멸이 불충분한 암의 경우, 암세포의 세 포성장주기를 정지시키거나 세포사멸 활성유도가 암 치료제로써 효과 적인 전략이 될 수 있으며, 항암제 대부분이 세포사멸을 유도하는 기전 을 가지고 있다[11]. Caspase는 세포사멸에서 매우 중요한 역할을 수 행하는 효소로, caspase-2, -8, -9, -10은 initiator caspase이며, caspase-3, -6, -7은 세포사멸을 수행하는 effector caspase이다 [9,11]. 또, Bcl-2 단백질 계열은 미토콘드리아 외막에서 세포사멸을 조절하기도 하며, 이들 중 항-세포사멸 인자인 Bcl-2 및 Bcl-xL과 세 포사멸 촉진인자인 Bax 및 Bad가 대표적으로 조직 및 기관의 세포 수 항상성을 유지한다[9,11,12]. 따라서 많은 항암물질들이 이러한 인자들 의 활성을 통해 세포사멸 기전을 연구하며, 이는 항암 효능의 지표로 간 주되고 있다.

해조류는 높은 단백질, 지질 및 비타민을 함유하고 있어 세계 여러 지 역에서 인간과 동물의 먹이 또는 유기 비료로 광범위하게 사용되어왔다 [13,14]. 이들의 서식지는 주로 강력한 자외선, 산소가 없는 깊은 바닷 속 또는 중금속 등으로 오염된 환경 등으로 이런 특수한 환경에서도 견 디기 때문에 이들로부터 다양한 생리활성 및 그 유효성분을 밝히는 연 구가 활발히 진행되고 있다[13,15-17]. 납작파래(Ulva compressa Linnaeus)는 광합성을 하는 녹조식물문에 속하는 녹조류로 조간대의 바위에 자라며 화장품, 음식 재료로 사용되고 있다. 납작파래는 구리로 오염된 바다에서 우점종하는 것으로 알려져 구리 내성에 대한 기전으로 항산화 연구가 많이 보고되어 있으며, Pradhan 연구팀은 최근 OSCC 에서 납작파래 메탄올추출물이 항산화 기전을 통해 항암효과가 있다고 보고하였다[15,17,18]. 그러나 이 외 구강암의 항암활성에 대한 기전 은 전무하며, 이에 본 연구에서는 납작파래를 이용하여 사람 유래 하인 두 편평암세포종에서 항암활성과 caspase에 매개되는 기전을 규명하 여 구강암 치료제 개발을 위한 강력한 후보물질로써 이용가능성을 제시 하고자 한다.

Materials and Methods

1. 실험 재료

국내산 납작파래는 2021년도 겨울에 전라남도 완도 위판장에서 구 입하여 민물로 가볍게 세척하여 건조한 후 사용하였다. 30% 주정 을 이용하여 90도에서 2시간 환류추출 후 동결건조하였으며, 추출분 말은 성장배지에 녹여 실험에 이용하였다. 주정은 신고 후 주류판매 업으로부터 구입하였으며, Live/Dead^TM Viability/Cytotoxicity kit 는 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)에서 구입하였 다. 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)와 4‘6-diamid-ino-2-phenylindole (DAPI)은 Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 1차 항체 cleaved caspase-9 (#9505), -3 (#9661), -7 (#8438), poly (adenosine diphosphate ribose [ADP]-ribose) polymerase (PARP, #9532), Bcl-2 (#15071) 및 Bax (#41162)는 Cell signaling Technology (Danvers, MA, USA), α-tubulin은 Invitrogen (Camarillo, CA, USA, #32-2500)에서 구입하여 사용하였다.

2. 납작파래 30% 주정추출물 제조(30% PeUCL)

납작파래 50 g을 20배수의 30% 주정과 혼합하여 95도에서 2시간 동안 환류추출하고 여과지를 이용하여 추출액을 filtering (pore size: ∅240 mm) 한 뒤 감압 농축하였다. 동결건조 후 분말 추출물을 성장배 지에 2 mg/mL로 녹여 syringe filtering한 후 사용하였다.

3. 세포 배양

사람 인두 편평암세포 FaDu (CCL-17^TM; ATTC, Manassas, VA, USA)와 마우스 fibroblast L929 세포(KCLB, Seoul, Korea)는 10% fetal bovine serum (FBS; iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea) 및 항생제(100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin) 가 함유된 minimum essential medium (MEM; Welgene, Daegu, Korea)을 사용하여 5% CO₂, 37℃ incubator 조건으로 배양하면서 실 험에 사용하였다.

4. 세포 성장률 분석

30% PeUCL의 정상세포 및 암세포의 생존율에 미치는 영향을 알아 보기 위해 MTT 기법을 이용하여 각 세포의 생존율을 분석하였다. 12 well plate에 well당 2 × 10⁵개의 L929 및 FaDu 세포를 접종하여 overnight 배양한 후, 0, 0.062, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mg/mL의 30% PeUCL를 접종한 다음 24시간 동안 반응하였다. 추출물 반응 후 배양 액을 제거하고 phosphate-buffered saline (PBS)으로 가볍게 세정한 후, 100 uL의 MTT (5 mg/mL) 용액을 첨가하여 37℃의 5% CO₂ incubator에서 4시간 반응하였다. 반응 후, 배양액을 제거하고 dimethyl sulfoxide로 formazan염을 녹여내어 590 nm에서 흡광도를 측정하였 다. 분석은 추출물을 처리하지 않는 대조군의 흡광도를 100%로 하고 추출물을 처리한 실험군의 흡광도를 대조군과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

5. Live & Dead assay

12 well plate에 2 × 10⁵개의 L929 세포와 FaDu 세포를 접종하여 overnight 배양한 후, 0.25, 0.5, 1 mg/mL의 30% PeUCL을 처리 하여 24시간 동안 반응하였다. 반응 후, 배양액을 제거하고 1X PBS에 희석된 live dye (calcein AM, Green)와 dead dye (EthD-1, Red) 를 1 μL:3 μL 비율로 혼합한 후, 각 well에 0.5 mL씩 첨가하여 37℃ incubator에서 5분간 염색하였다. 염색한 L929 세포와 FaDu 세포를 형광현미경(Eclipse TE2000; Nikon Instruments, Tokyo, Japan)을 이용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 비교 분석하였다.

6. DAPI 염색

6 well plate에 2 × 10⁵개의 FaDu 세포를 접종하여 overnight 배 양한 후, 0.25, 0.5, 1 mg/mL의 30% PeUCL을 처리하고 24시간 동 안 반응하였다. 반응 후, 배양액을 제거하고 1X PBS로 가볍게 세정한 뒤 4% paraformaldehyde를 이용하여 5분간 고정하였다. DAPI (300 nM)를 이용하여 5분간 염색한 뒤 형광현미경(Eclipse TE2000)을 이 용하여 세포사멸이 유도된 세포의 핵형 및 세포질 형태를 분석하였다.

7. Colony formation 측정

6 well plate에 well당 2 × 10⁵개의 FaDu 세포를 접종하여 overnight 배양한 후, FaDu 세포에 대한 30% PeUCL의 non-cytotoxicity 농도인 0.05 mg/mL와 0.1 mg/mL을 처리한 다음 24시간 동안 반 응하였다. 24시간 후, 2일마다 새로운 배양액으로 교체하며 추출물 처 리 없이 4일 동안 배양하였다. 배양액을 제거하고 PBS로 가볍게 세정 한 다음 99% 에탄올을 이용하여 5분간 고정하였다. 고정 후 완전히 말 린 다음 0.1% crystal violet 용액을 첨가하여 3분간 염색하였다. PBS 로 염색되지 않은 부분을 세척한 후 Canon PowerShot G16 (Canon, Tokyo, Japan)으로 형성된 colony를 관찰하였다.

8. Wound healing assay

24 well plate에 well당 4 × 10³개의 FaDu 세포를 접종하여 overnight 배양한 후, cell scratcher를 이용하여 wound를 생성하였다. 1X PBS로 깨끗하게 세정한 뒤, 30% PeUCL의 non-cytotoxicity 농도 인 0.05, 0.1 및 0.2 mg/mL을 처리하였다. 3일 뒤 control 군의 모두 healing 되는 시점에 EVOS XL CORE (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 각 군에서 healing 정도를 분석하였다.

9. 단백 발현 분석

6 well plate에 well당 2 × 10⁵개의 FaDu 세포를 접종하여 overnight 배양한 후, 0.25, 0.5, 1 mg/mL의 30% PeUCL을 처리하여 24시간 동안 반응하였다. 부유세포 및 plate에 붙어있는 세포를 모두 수확한 뒤, 1X PBS로 두 번 세정한 다음, protein extraction buffer (iNtRON Biotechnology)를 이용하여 whole protein을 얻었으 며, Pierce^TM BCA Protein kit (Thermo Fisher Scientific)을 이용하 여 정량하였다. 동량의 20 μg 단백질을 5X sample buffer와 혼합하 여 95℃에서 5분간 변성시킨 뒤, 10% 혹은 12% sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis에서 전기영동한 후, polyvinylidene fluoride membrane으로 이동시켰다. Membrane 은 5% blocking solution (5% bovine serum albumin in trisbuffered saline [TBS] containing 0.1% Tween-20)에서 30분 동 안 blocking하고, 1차 항체인 cleaved caspase-9, cleaved caspase- 3, cleaved caspase-7, PARP, Bax, BCL-2는 1:1,000으로 희석하고, α-tubulin은 1:2,000으로 희석하여 4℃에서 overnight 반 응하였다. 이후, TBS-with Tween 20 (TBS-T)로 20분씩 3번 세척 한 다음, horseradish peroxidase가 접합된 2차 항체로(1:5,000) 1 시간 반응한 다음 TBS-T로 10분씩 3번 세척하였다. 결과 분석은 ECL kit (Millpore, Burlington, MA, USA)을 이용하여 MicroChemi 4.2 (DNR Bio-Imaging Systems Ltd., Neve Yamin, Israel)를 통해 protein band를 가시화하였다.

10. 통계적 유의성

모든 실험성적은 mean ± standard deviation으로 나타내었고, 각 실험군 간의 유의성 검정은 Graphpad prism 5.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 이용하여 Tukey t-test를 하였으며, p-value가 0.05 미만(p ＜ 0.05)의 경우에 통계적 유의성이 있는 것으 로 간주하였다.

Results

1. L929 세포 및 FaDu 암세포에 대한 30% PeUCL의 세포 독성효과

L929 세포와 FaDu 암세포의 세포생존율에 미치는 30% PeUCL의 영향력을 평가하기 위해, MTT assay와 Live & Dead assay를 수행하 였다. 30% PeUCL을 0.062, 0.125, 0.25, 0.5 및 1 mg/mL로 24시 간 동안 처리하였을 때, 정상세포인 L929의 생존율에는 영향을 미치지 못하였으나 암세포인 FaDu는 증식이 유의적으로 억제되는 것을 확인 하였다(Fig. 1A and 1B). 30% PeUCL이 0.5 mg/mL부터 세포독성 효과를 보였으므로 이후 모든 실험은 0.25, 0.5, 1 mg/mL로 처리하 여 수행하였다. MTT assay로 확인한 세포독성효과를 live & dead 염 색 시약을 통해 확인한 결과, 살아있는 세포를 나타내는 녹색 형광과 죽 은 세포를 나타내는 붉은 형광이 대조군과 1 mg/mL이 처리된 L929 세포와의 유의성이 없었으나, FaDu 암세포에서는 농도-의존적으로 붉 은 형광이 점차 많아지는 것을 확인하였다(Fig. 1C).

2. DAPI 염색을 이용한 30% PeUCL에 의한 FaDu 암세포의 세포핵 행태 변화

30% PeUCL에 의한 FaDu 암세포의 성장억제 효과가 세포사멸에 의한 것인지 확인하기 위해 DAPI 염색을 수행하였다. 그 결과, 30% PeUCL이 처리된 농도-의존적으로 FaDu 암세포의 세포질 위축, 염색질 응축, 핵 깨짐 등 세포사멸된 핵의 형태학적 변화를 확인하였다(Fig. 2).

3. FaDu 암세포의 colony formation과 wound-healing에 대한 30% PeUCL의 억제효과

30% PeUCL이 FaDu 암세포의 무제한 증식 능력 또한 억제할 수 있 는지 확인하기 위해 colony formation 분석을 수행하였다. 세포 독성 을 나타내지 않는 0.05, 0.1 mg/mL을 FaDu 암세포에 24시간 동안 처리한 후, 10% FBS가 함유된 정규 배양액으로 교체해주면서 5일 동 안 추가 배양하였다. 이후, crystal violet 염색을 통해 형성된 콜로니를 분석한 결과, 대조군과 비교하여 0.05 mg/mL부터 콜로니 형성이 억 제되었으며 0.1 mg/mL을 처리한 군에서 FaDu 암세포의 콜로니 형성 능력이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 3A). 또, 30% PeUCL 에 FaDu 암세포의 wound-healing에 대한 영향력을 분석하였으며, 그 결과, 0.05 mg/mL부터 wound-healing 능력을 억제하였으며, 30% PeUCL의 농도 의존적으로 그 영향을 미치는 것을 확인하였다 (Fig. 3B).

4. FaDu 암세포에 대한 30% PeUCL의 세포사멸관련 단백질 발현 유도

Caspase는 세포사멸을 수행하는 단백질 효소로, 이들 단백질의 활 성 여부는 세포사멸을 평가하는 데 중요한 지표가 된다. 따라서 30% PeUCL에 의한 FaDu 암세포의 세포사멸이 caspase의 활성과 관련 되어있는지 확인하기 위해 cleaved caspase의 발현을 분석하였다. FaDu 암세포에 30% PeUCL을 0.25, 0.5, 1 mg/mL을 24시간 동안 처리한 결과, caspase-9, caspase-3 및 caspase-7의 가수분해가 유도됨을 확인하였다(Fig. 4A). 또한, 미토콘드리아 막에서 세포사멸을 조절하는 Bcl-2 family 단백 발현을 확인한 결과, 30% PeUCL을 처 리한 실험군에서 anti-apoptotic 인자인 Bcl-2 단백 발현이 감소하였 으며, pro-apoptotic 인자인 Bax의 단백 발현이 증가됨을 확인하였다 (Fig. 4B).

Discussion

납작파래는 광합성을 하는 녹조류에 속하는 해조류로 바이오연료를 얻기 위한 연구뿐만 아니라 최근 구리, 카드뮴으로 오염된 바다에서 우 점종하는 것으로 알려져 구리 내성에 대한 기전을 밝히기 위해 다양한 연구가 보고되고 있다[15,18,19]. 그러나 납작파래의 항산화 효능 외에 다양한 생리활성 및 그 기전에 대해서는 연구가 매우 부족하다. 따라서 본 연구에서 납작파래 주정추출물(30% PeUCL)의 효과적인 항암활성 및 그 기전을 분석하고자 한다.

암세포의 가장 대표적인 특징이 무제한 증식이므로, 우리는 가장 먼 저 30% PeUCL이 FaDu 암세포의 증식에 영향을 미치는지 분석하였 다. 30% PeUCL를 FaDu 암세포에 다양한 농도로 24시간 처리한 결 과, 0.5 mg/mL부터 암세포의 증식을 억제한 반면, 1 mg/mL에서도 정상세포인 L929 세포의 증식에는 영향을 미치지 않았다. Live 형광 과 Dead 형광을 이용하여 확인한 결과, 30% PeUCL의 농도가 높아 질수록 FaDu 암세포에는 살아있는 세포를 나타내는 형광이 점차 줄어 들고 죽은 세포를 나타내는 형광이 점차 많아진 반면 L929 세포에서는 군 간의 형광 변화가 없었다. 30% PeUCL의 FaDu 암세포의 성장억제 효과가 세포사멸에 의한 것인지 알아보기 위해 DAPI 염색을 수행한 결 과, 30% PeUCL을 처리한 군에서 세포사멸의 특징인 핵의 응축과 염 색질의 분절이 관찰되었다. 이러한 결과는 다른 여러 천연물을 이용한 항암효능 연구결과와 일치하는 것으로, 해초 둥근해호말의 phenolic 추출물을 유방암 세포인 MCF-7에 처리하자 농도 의존적으로 세포 성 장을 억제하였으며 DAPI 염색 결과를 통해 추출물의 유방암세포 성장 억제가 세포사멸 기전에 의해 매개될 수 있음을 확인하였다[20]. 강황 에탄올추출물은 정상세포의 성장에도 최소한의 영향을 미쳤으나, 간 암세포(Hep3B)와 유방암세포(SKBR3)의 성장을 효과적으로 억제하 였으며 DAPI와 FACS 분석을 통해 이러한 성장억제가 세포사멸 유도 에 의해 매개됨을 보고하였다[21]. 암세포의 무제한 증식은 densitydependent inhibition과 contact inhibition에 대한 저항성을 가지 고 있기에 가능한 것으로, 밀도와 이웃세포의 접촉이 있음에도 불구하 고 계속적으로 증식하여 다층구조를 갖게 된다. 따라서 콜로니 군집과 wound-healing에 대한 30% PeUCL의 효과를 분석하기 위해 세포독 성이 없는 농도를 처리하여 분석한 결과, 대조군에 비해 0.1 mg/mL에 서 콜로니 형성 억제 및 wound-healing 능력이 완전히 억제됨을 확인 하였다. 이는 다른 항암활성을 연구한 결과와 일치하는 것으로, Ke 연 구팀은 회향(Foeniculum vulgare) 씨앗의 75% 에탄올추출물이 10% 미만의 세포독성을 나타내는 농도에서 폐암세포주인 NCI-H446과 NCI-H661의 콜로니 형성과 wound-healing 능력억제를 통해 추출 물의 항암활성을 보고하였으며, Nelseon 연구팀은 가는잎한련초 메탄 올추출물이 대장암세포(HCT-116), 전립선암세포(PC-3), 유방암세포 (MCF-7), 신장암세포(RCC-38)의 colony formation 및 migration 억제를 통해 항암활성을 보고하였다[22,23]. 암세포의 성장억제 및 세 포사멸 유도뿐만 아니라 세포독성이 없는 농도에서도 암세포의 성질을 억제하는 것은 항암효능이 매우 효과적임을 시사한다.

암세포의 세포사멸 유도는 항암제 개발의 매우 효과적인 전략으로, 항암제 대부분이 이러한 기전을 기반으로 하고 있다[24]. 30% PeUCL 에 의한 FaDu 암세포의 성장억제효과가 세포사멸에 의한 것인지 알아 보기 위해 대표적인 세포사멸 기전인 caspase 신호전달체계를 분석하 였다.

세포사멸 신호는 신호 경로를 통해 전달되어 궁극적으로 세포 파괴 의 실행을 담당하는 caspase의 활성화로 이어진다. Caspase는 cystein- 의존적인 단백질 가수분해 효소로, aspartic acid 잔기 이후에 기 질을 가수분해하여 활성이 개시된다[25]. 이들 중, 개시 caspase-8, -9, -10은 이들의 동원 및 활성화를 촉진하며 caspase-3, -6, -7은 사멸 유도의 효과를 나타내는 것으로 알려져 있으며, caspase들의 활 성은 death-receptor의 리간드 결합을 통한 외인성 경로뿐만 아니라 미토콘리아에 의한 내인성 신호전달과도 밀접하게 관련되어있어, 세 포생존에 필요한 요소들을 결핍시킴으로써 세포사멸을 유도하는 것으 로 알려져 있다[26,27]. 30% PeUCL을 처리한 군에서 caspase-9 의 가수분해가 유도되었으며, 이는 세포사멸이 개시되었음을 시사하며, caspase-3, -7의 가수분해를 통해 세포사멸의 효과가 유도되었음을 시사한다. 이러한 세포사멸의 결과로 DNA 회복기능을 담당하는 PARP 가 절단되었다. 또, 항세포사멸인자인 Bcl-2의 단백발현 감소 및 세포 사멸 인자인 Bax의 단백발현 증가를 확인하였다. 이러한 결과는 다른 천연자원 추출물들의 항암효과 및 기전과 일치하는 것으로, 가는잎한련 초 메탄올추출물은 대장암세포, 전립선암세포, 유방암세포, 신장암세 포의 성장 억제 및 caspase 기전을 통해 세포사멸을 유도한다고 보고 하였으며, 라즈베리 추출물은 자궁경부암 세포(HeLa)의 항성장인자인 P53와 세포사멸인자인 FAS의 발현을 증가시킴으로써 caspase-3 활 성을 통해 세포사명을 유도한다고 보고되어 있다[23,28]. 그러나, 항암 제 개발을 위한 기능성소재로 이용되기 위해서는 다양한 암세포 및 그 유효성분에 대한 규명이 이루어져야 할 것으로 생각된다.

결론적으로, 본 연구에서는 30% PeUCL에 의한 사람 인두 편평암세 포 FaDu의 성장억제가 caspase- 및 미토콘드리아-신호전달체계를 통한 세포사멸에 의해 매개될 수 있음을 시사한다.