Introduction
치수는 단단한 상아질에 둘러싸인 느슨한 결합 조직이며 상아질-치수 복합체의 생리학적 항상성 유지에 필수적인 조직으로 알려져 있다[1]. 치수 내 세포가 풍부한 영역(cell-rich zone)에 존재하는 인간치수줄기 세포(human dental pulp stem cells, HDPSCs)는 치수의 감염 또는 손상에 빠르게 반응하게 된다[2]. HDPSCs의 증식, 이동 및 치성 또는 골분화를 통해 조직의 복구에 중요한 역할을 한다[3]. HDPSCs는 다중 계통으로의 높은 분화 잠재력을 가진 중간엽 줄기세포이며, 인체 내 다 른 조직 유래 중간엽 줄기세포들에 비해 발치를 통한 추출의 용이함 때 문에 재생 의학 및 조직 공학에서 유망한 자원으로 간주되고 있다[4].
Naringin은 플라바논 배당체(flavanone glycoside)로 착생 양치 류 Drynaria fortunei의 주요 유효 성분으로 간주되며 토마토, 자몽 및 감귤류에서도 흔히 발견된다[5]. 지금까지의 연구에 따르면 naringin 은 항염증, 항산화, 항암, 항바이러스, 면역조절 및 신경보호 효능을 가 지는 것으로 연구되어 왔다[6,7]. 최근에는 naringin이 다양한 유래의 전구세포들의 골분화 및 골형성에 관여된다고 보고되었다. Naringin 은 골형성단백질(bone morphogenetic protein)의 발현과 Wnt/ β-catenin 신호전달경로의 활성화를 증가시켜 인간양수 유래 줄기세 포의 증식 및 골분화를 촉진한다고 보고되었다[8]. Naringin은 뼈 유 래 중간엽 줄기세포의 골형성을 유도함으로써 골다골증 발병을 개선한 다고도 한다[9]. 그리고 naringin은 골절 치유에 중요한 역할을 하는 세 포성 chemokine 합성 및 중간엽 기질세포의 이동을 촉진시킨다고 보 고되고 있다[10]. 최근에는 naringin이 치주인대 줄기세포의 증식을 촉 진시키며 세포 내 ERK1/2 신호경로를 통해 골분화를 증가시킨다고 보 고되었다[11]. 이와 같이 naringin은 다양한 유래의 중간엽 줄기세포들 의 활성에 영향을 미쳐 줄기세포들의 증식, 이동, 골분화를 촉진시킴으 로써 재생효율을 높인다고 다양한 연구들에서 보고되고 있다. 지금까지 naringin이 치수줄기세포의 생물학적 활성에 어떠한 영향을 주는 지에 대해서는 많은 연구가 되어 있지 않았다. 따라서 본 연구에서는 naringin이 HDPSCs의 이동 및 골분화에 미치는 영향을 조사하고 그 기전을 조사하였다.
Materials and Methods
1. 실험 재료
Naringin, AMD3100, β-glycerophosphate disodium salt pentahydrate, ascorbic acid, dexamethasone, alkaline phosphatase (ALP) detection kit는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, ARP100는 Tocris bioscience (Bristol, UK)에서 구 입하여 사용하였다. Western blotting을 위한 C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4), matrix metalloproteinase-2 (MMP-2), β-actin 항체들은 각각 Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA), Abcam (Cambridge, UK), Bioworld Technology (St. Louis Park, MN, USA)에서 구입하였다.
2. 세포 배양
HDPSCs는 Lonza (Basel, Swizerland)에서 구입하였으며, 10% fetal bovine serum (FBS, Merck Millipore, Burlington, MA, USA)와 1% penicillin-streptomycin (GibcoBRL, Billings, MT, USA), 5 μg/mL Plasmocin (Invivogen, San Diego, CA, USA)이 첨가된 α-modification of Eagle’s minimum essential medium (α-MEM, Thermo Fisher Scientific) 배지를 첨가하여 5% CO2가 공 급되는 37℃ 세포 배양기에서 배양하였다. 골형성 분화를 위해, HDPSCs는 10 mM β-glycerophosphate, 50 μg/mL ascorbic acid, 0.1 mM dexamethasone을 포함한 배지에서 14일 동안 배양되었으며, 배지는 2–3일마다 새로 바꿔주었다. 6–7세대 사이의 HDPSCs를 실험 에 사용하였다.
3. 세포 성장률 분석
48-well plate에 2 × 104개의 HDPSCs를 첨가하고 naringin을 농 도별로 처리한 후 24, 48, 또는 72시간 동안 배양하였다. 24, 48, 또 는 72시간 후에 새로운 배지로 교체한 후, 0.5 mg/mL 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (Sigma- Aldrich)를 첨가하여 배양하였다. 4시간 후 Microplate Reader (Allsheng, Hangzhou, China)로 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하 였다.
4. 세포 이동 능력 분석(transwell migration assay)
Transwell migration chamber (Corning Life Science, Tewksbury, NY USA)의 low chamber에 10% FBS를 함유한 α-MEM에 HDPSCs의 이동을 유도하는 naringin 5 μM 또는 10 μM을 넣었다. Upper chamber의 insert에는 1 × 105개의 HDPSCs를 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 메탄올(SK chemical, Seongnam, Korea)로 고정시키고, hematoxilin 및 eosin (DAKO, Hamburg, Germany)으로 염색시킨 후 이동하지 않은 세포를 제거한 뒤 염색된 세포를 광학현미경(Nikon, Tokyo, Japan)으로 관찰하며 계수하였다.
5. 상처 치유 이동 분석(wound healing migration assay)
1 × 105개의 HDPSCs를 35 mm plate에 첨가하여 24시간 동안 배 양하였다. 배양 후 scraper를 이용하여 세포 단층에 빈 공간을 만들고, 부유된 세포는 일반 배양 배지(10% α-MEM)로 1–2회 세척하여 제거 하였다. Naringin 5 μM 또는 10 μM을 첨가하여 24시간 동안 배양 후 세포의 이동 능력을 현미경으로 관찰하여 계수하였다.
6. 실시간 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcriptionquantitative real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)
HDPSCs에서 total RNA를 추출하기 위해 RiboEx reagent kit (GeneAll Biotechnology, Seoul, Korea)를 사용하였다. Reverse transcription kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 2 μg의 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 human β-actin (sense: 5′-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3′, antisense: 5′-TGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3′), human CXCR4 (sense: 5′ -AAATGGGCTCAGGGGACTAT-3′, antisense: 5′-TCCCAAAGTACCAGTTTGCC- 3′), human MMP-2 (sense: 5′-ACCGTCGCCCATCATCAA- 3′, antisense: 5′-TTGCACTGCCAACTCTTTGTCT-3′), human ALP (sense: 5′-ATTTCTCTTGGGCAGGCAGAGAGT-3′, antisense: 5′-ATCCAGAATGTTCCACGGAGGCTT-3′)의 primer를 각 각 이용하여 역전사 중합효소연쇄반응을 시행하였다. Real-time PCR 은 SYBR Green (Enzynomix, Daejeon, Korea) 시약을 이용하였으 며, 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 기기를 사용하여 실시하였다.
7. Western immunoblot analysis
수확한 HDPSCs를 PBS로 세척한 후 세포용해 용액(iNtRON Biotechnology, Seongnam, Korea)으로 용해시켰다. 20 μg의 전체 단 백질을 8–10% gel로 SDS-PAGE (poly acrylamide gel electrophoresis) 하였고, 이를 nitrocellulose membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Chicago, IL, USA)에 전이시켰다. 5% skim milk가 함유된 TBS-T (TBS, 0.1% Tween 20) 용액으로 상온에서 1 시간 동안 membrane을 blocking한 후, 단백질의 발현을 측정하기 위 해 적절한 1차 항체를 4℃에서 반응시켰다. 이어서 TBS-T 용액으로 세척한 후 이차 항체를 실온에서 2시간 반응시키고, 다시 TBS-T 용액 으로 세척한 다음 ECL Detection Reagent (Amersham Pharmacia Biotech) 를 반응시킨 후 LAS4000 (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) 기기로 단백질 발현을 확인하였다.
8. ALP 염색
ALP staining kit (86R-1KT; Sigma-Aldrich)의 설명서에 따라 사 용하였다. 48 well plate당 5 × 104개의 HDPSCs를 심은 후, 일반 배 양 배지(10% α-MEM) 또는 골형성 분화 배지(osteogenic differentiation medium, ODM)에 14일 동안 배양시켰다. 14일 후 ALP fixing 용액으로 30초간 고정시키고, 세척한 후 Alkaline-Dye 용액을 각 well에 첨가한 후 상온에서 빛을 차단하여 최대 30분간 반응시켰다. 반 응시킨 세포는 2–3회 증류수로 세척한 후 염색된 정도를 사진화하였다.
9. Alizarin red S (ARS) 염색
HDPSCs를 일반 배양 배지(10% α-MEM) 또는 ODM에서 14일 동 안 배양시킨 후 배지를 제거하고 4% paraformaldehyde (Biosesang, Seongnam, Korea)에 15분 동안 고정하였다. 고정시킨 후 2% ARS (Sigma-Aldrich) 용액을 상온에서 30분간 염색시키고 2–3회 증류수 로 세척하여 칼슘이 염색된 정도를 관찰하였다.
10. 통계처리
모든 실험 결과는 세 번 이상 실험하여 얻어진 값으로 평균 및 표준편 차로 표시하였고, 대조군과 실험군 간의 통계적 차이는 Student's t- test를 적용하여 분석하였다.
Results
1. Naringin이 HDPSCs의 이동에 미치는 영향
먼저 naringin이 HDPSCs의 증식에 미치는 영향을 MTT assay를 통해 확인하였다. Naringin을 처리하여 HDPSCs의 증식을 확인한 결 과, 5 μM naringin 또는 10 μM naringin이 표시된 시간 동안 처리된 HDPSCs에서 증식률이 12% (± 4.8%, p ＜ 0.01) 증가되었다(Fig. 1A). 상아질-치수 복합체의 수복 재생을 위해서는 HDPSCs의 손상된 부위로의 화학주성 이동이 필수적인 단계로 여겨지고 있다[12]. 따라서 본 연구에서는 naringin이 HDPSCs의 이동에 미치는 영향을 관찰하였 다. 대조군에 비해 5 μM 및 10 μM naringin를 처리하였을 때 HDPSCs의 이동이 각각 2.5배(± 0.4배, p ＜ 0.01) 및 3.2배(± 0.5배, p ＜ 0.01) 증가됨을 확인하였다(Fig. 1B). 또한 HDPSCs의 naringin이 촉진시키는 이동능을 정성적으로 관찰하기 위해 wounding migration assay를 수행하였다. Fig. 1C에서 보는 바와 같이 대조군에 비해 5 μM의 naringin을 처리한 군에서 HDPSCs의 이동이 1.8배(± 0.2배, p ＜ 0.01) 증가하였고, 10 μM naringin을 처리한 군에서는 긁힌 상처 로 이동되는 세포수를 대조군에 비해 2.4배 (± 0.2배, p ＜ 0.01) 증가 시켰다.
2. Naringin이 HDPSCs의 CXCR4 및 MMP-2 발현에 미치는 영향
CXCR4는 치수 염증에 중요한 역할을 하는 G-단백질 결합 수용체 로 stromal cell derived factor-1 (SDF-1)에 결합하여 손상 부위로 HDPSCs가 이동하는 것을 조절한다[13]. MMP-2는 dentin matrix 에 우세하게 존재하는 단백질분해효소로 세포외기질을 분해시키며 주 변세포들의 이동을 용이하게 하여 치아형성과정에서 중요한 역할을 한 다고 알려져 있다[14]. 따라서 naringin이 HDPSCs의 이동에 관계된 분자들인 CXCR4 및 MMP-2의 발현에 미치는 영향을 조사하기 위해 농도별로 naringin를 처리하여 CXCR4 mRNA 및 MMP-2 mRNA 발 현을 real-time RT-PCR로 확인하였다. Fig. 2A에서 보는 바와 같이 HDPSCs에 naringin을 처리하였을 때, CXCR4 mRNA 또는 MMP-2 mRNA 발현이 증가됨을 관찰하였다. 그리고 naringin를 HDPSCs에 처리하였을 때 대조군에 비해 CXCR4 및 MMP-2의 단백질 발현 또한 증가되고 있음을 Western blot 분석법을 통해 확인할 수 있었다. 특히 CXCR4는 5 μM의 naringin에서 크게 증가됨을 관찰하였다(Fig. 2B).
3. Naringin이 유도한 HDPSCs의 이동에서 CXCR4 및 MMP-2의 관련성
Naringin이 유도한 HDPSCs의 이동에 CXCR4 및 MMP-2가 실제 로 관여하는지를 조사하기 위해 MMP-2 및 CXCR4의 기능을 억제한 상태에서 wounding migration 분석법을 이용하여 HDPSCs의 이동 을 확인하였다. Fig. 3A에 도시된 바와 같이, MMP-2의 강력한 선택 적인 저해제[15]로 알려진 ARP100으로 전처리하였을 경우 naringin 이 유도한 HDPSCs의 이동이 58% (± 6.8%, p ＜ 0.01)까지 유의 하게 감소되었다. 다음은 선택적 CXCR4 길항제인 AMD3100 [13] 으로 전처리한 후 naringin에 의한 HDPSCs의 이동능을 관찰하였다. AMD3100 처리는 naringin이 유도한 HDPSCs가 긁힌 상처로 이동하 는 세포의 수를 55% (± 4.8%, p ＜ 0.01)까지 감소시켰다(Fig. 3B).
4. Naringin이 HDPSCs의 골분화능에 미치는 영향
Naringin이 HDPSCs의 골분화에 미치는 영향을 조사하기 위해 14 일 동안 naringin을 첨가하여 ODM에서 배양한 후, ALP mRNA의 발 현량에 미치는 영향을 알아보았다. ODM에서 배양된 HDPSCs에 비 해 naringin을 첨가한 ODM에서 배양된 세포에서는 ALP의 상대적 mRNA 발현 수준이 증가되고 있음을 확인하였다(Fig. 4A). 그리고 ALP 염색을 통해 분화 정도를 확인하였다. Fig. 4B에 나타난 바와 같 이, ODM는 기본 성장배지와 비교하여 HDPSCs의 ALP 염색을 증가 시켰다. 그리고 naringin을 ODM에 첨가하여 분화시켰을 때 ODM 단 독 배양에 비해 naringin를 첨가하였을 때 골분화 정도가 증가됨을 확 인하였다(Fig. 4B). 나아가서 배양된 HDPSCs의 광물화는 ARS 염색 법으로 확인하였다. 분화 유도 후 14일에 naringin이 처리된 HDPSCs 는 처리되지 않은 HDPSCs보다 높아진 세포외 칼슘 침착이 관찰되었 다. 5 μM naringin을 ODM에 첨가한 후 배양한 세포는 ODM 단독 처 리군과 비교했을 때, 칼슘 침착이 2.2배(± 0.1배, p ＜ 0.01) 증가하 였고, 10 μM naringin가 처리되었을 때는 2.3배(± 0.2배, p ＜ 0.01) 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 4C).
Discussion
HDPSCs를 활용한 조직 공학은 치아 조직 및 치아 재생을 위한 잠재 력을 가지고 있으며, 골 조직 성장 및 수복을 가능케 한다고 한다[16]. HDPSCs는 접근성이 좋아 분리가 용이하고 윤리적 논란이 없기 때문 에 재생의학을 위한 중간엽 줄기세포의 매력적인 공급원으로 여겨지고 있다[4]. 그리고 HDPSCs를 활용한 조직공학의 효율을 높이는 전략 중 하나는 HDPSCs의 생물학적 활성 및 효능을 높이는 생리활성 물질 또 는 분자들을 첨가하는 것이다[17]. 골재생을 위해 HDPSCs가 적용될 때 HDPSCs가 손상된 부위로 이동하고, 골모세포로 분화되는 것이 주 요한 과정으로 알려져 있는데, 생리활성물질 첨가로 인해 이러한 생물 학적 활성이 증가되어 재생잠재력을 높일 수 있게 된다[18]. 본 연구의 결과에서 naringin이 스크래치 상처 치유 이동 및 transwell 화학주성 이동 분석에 기초하여 HDPSCs의 이동 능력을 유의하게 증가시켰음을 보여주었다. 또한 naringin은 HDPSCs의 ALP 활성과 광물화된 결절 형성 향상을 통해 골형성을 촉진시키고 있음을 증명하였다.
SDF-1α 및 수용체 CXCR4은 신경, 골수, 치수 등 다양한 조직에 존 재한다고 알려져 있다[19,20]. 치수에서 SDF-1α 및 CXCR4의 발현 은 염증, 저산소 상태 및 치성유도에 의해 증가된다고 한다[20-22]. 또 한 근관 치료에 사용되는 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) 는 CXCR4 발현을 증가시켜 치수 세포의 이동을 촉진시킨다고 한다 [23]. 저산소 상태에서 배양된 HDPSCs는 CXCR4 발현이 높아지고 이 러한 HDPSCs가 SDF-1로의 이동능 증가를 통해 감염성 골 결손을 효 과적으로 치유한다고 보고하고 있다[24]. 이처럼 치수세포 및 치수줄기 세포의 이동에 SDF-1α-CXCR4 축의 역할은 다양한 연구들에 의해서 증명되어왔다. 본 연구에서 CXCR4 길항제인 AMD3100가 naringin 이 유도한 인간치수세포의 이동능을 억제시키는 것으로 보아 naringin 에 의해 자극된 HDPSCs의 이동 능력에 SDF-1α-CXCR4 축이 관여 한다는 것을 알 수 있었다. AMD3100은 CXCR4와 SDF-1 간의 상호 작용을 억제하여 SDF-1/CXCR4 축이 관여하는 신호전달 경로를 차 단한다[13]. 한편 일부 보고에서는 고농도의 AMD3100이 CXCR7의 작용제로 작용하여 SDF-1/CXCR7 신호전달 경로를 활성화한다는 것 이 입증되었다[25,26]. 따라서 AMD3100이 SDF-1/CXCR7 신호 경 로를 활성화하여 치수줄기세포의 골형성 분화를 조절할 수 있는지에 대 해서는 추가 연구가 필요하다. 그리고 또 다른 보고에서 naringin은 혈 관전구세포의 이동 및 관형성능을 CXCR4/PI3K/Akt 신호전달 경로를 통해 촉진시킨다고 한다[27]. 항후 naringin이 치수줄기세포의 혈관내 피세포로의 분화를 촉진시킬 수 있는지에 관한 추가 연구도 필요하리라 생각한다.
다양한 MMP들이 상아질과 치수에서 확인되었으며 상아질 형성 의 초기 단계에도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[28]. 특히, MMP-2는 인간의 광물화된 상아질 기질로부터 분리되고 탈회된 상아 질에서도 확인되며, 우식 과정 동안 상아질 기질 파괴에 잠재적인 역할 을 한다[29-31]. MMP-2는 치아 발달의 후기 단계에서 일어나는 세포 외기질 단백질의 프로세싱에 관여하는 것으로 보고되었다[32]. 상아질 광물화에서 중심적인 역할을 하는 세포외기질 단백질인 Dentin Matrix Protein 1 (DMP1)의 아스파르트산과 세린이 풍부한 C 말단 도메인은 수산화인회석의 핵 생성을 담당한다고 한다[33,34]. 최근에 MMP-2에 의한 DMP1의 단백질 분해 프로세싱를 통해 생성된 펩타이드는 치수 줄기/전구 세포의 분화를 촉진시킨다고 보고되고 있다[35]. 본 연구에 서는 HDPSCs에서 naringin에 의해 증가된 MMP-2의 발현 및 관련 성을 확인하였다. 이렇게 생성된 MMP-2가 어떠한 단백질 분해 프로 세싱 과정을 거치는지, 그리고 치수줄기세포의 골분화에도 영향을 끼칠 수 있는지에 대해서도 연구가 필요하다고 생각한다.
본 연구는 naringin이 HDPSCs의 이동 및 골분화를 자극시킴으로써 생물학적 활성을 높이는 것을 증명하였다. 앞으로 실험동물에서 in vivo HDPSCs의 분화능에 있어 naringin의 생물학적 역할을 추가적으로 검 증할 필요가 있다. 종합적으로 naringin이 HDPSCs의 재생 잠재력을 촉진시키는 새로운 후보물질로 간주될 수 있을 것으로 여겨진다.
