Introduction

척추동물의 치아는 치아상피(dental epithelium)와 외배엽성중간엽(ecto-mesenchyme)에서 발현되는 분자표지인자들의 상호작용에 의해서 발생한다[1]. 치아 발생과정에서 가장 먼저 나타나는 특징으로는 치아상피를 구성하는 세포들의 극성으로 인해 두꺼워진 치아기원판 (dental placode)의 형성이다[2]. 이어서 치배는 발달시기에 따라 싹시기와 모자시기, 종시기로 구분되고, 이 과정에서 치배의 안쪽치아상피와 치아유두세포는 각각 법랑질모세포와 상아질모세포로 분화되어 법랑질과 상아질을 형성하게 된다[2]. 동물에 따라 대부분의 포유류의 치아는 일생치(monophyodont) 또는 이생치(diphyodont)이고, 다양한 파충류와 양서류, 어류의 치아는 주기적으로 반복되어 형성되는 계승치아와 기능치아로 구성된 다생치(polyphyodont)가 나타난다[3]. 다생치를 가진 동물에서는 반복되어 형성되는 치배에서 다양한 분자표지인자들의 발현을 관찰할 수 있고 한 개체에서 다양한 시기의 치배의 발달양상을 실험할 수 있는 장점이 있다[4].

생쥐의 치아기원판에서 Fgf8과 Pitx2, Shh, Bmp4의 발현이 관찰 되었고, 이 표지인자들의 발현부위가 치아기원판 형성 후 치배로 발달하는 부위로 확인됨으로써 이러한 표지인자들은 치아형성띠표지인자 (odontogenic band marker)라고 보고되었다[5]. Bmp4 는 Fgf8 과 Pitx2, Shh와는 다르게, 치아기원판에서 발현된 다음, 치아원기에서 싹시기로 진행되는 시기에 중간엽으로 옮겨져 발현되었고, Bmp4는 조직 재조합 연구에서 치아형성능(odontogenic potential)이 상피에서 중간엽으로 이동하는 현상과 유사한 발현양상을 보이고 있다[5].

Bmp4는 생쥐에서 치배형성 초기에 Fgf8의 발현에 대하여 반응인자 (competent factor)로 작용하고, 중간엽에서 Msx1과 Msx2의 발현을 유도하였다[6,7]. 조류에서 치아는 퇴화되었고, 구강상피에서 Bmp4의 발현은 관찰되지 않았다[8]. 뱀과 어류의 치배에서 Bmp4의 발현은 중간엽에서 확인되었고[9-11] 양서류의 치아 발생과정에서 형태학적 연구는 보고되었으나[12,13], Bmp4의 발현은 찾아보기 어렵다. 이에 본 연구에서는 아프리카산 발톱개구리의 계승치아 발생과정에서 반복되어 형성되는 치배 또는 치아에서 Bmp4의 발현양상을 확인하고자 하였다.

Materials and Methods

본 실험은 전북대학교 동물실험윤리위원회의 승인(승인번호 NON2022-094)하에 시행되었다.

1. 실험동물 및 조직표본 제작

올챙이에서 개구리로 변태된 후 3개월째 되는 아프리카산 발톱개구리의 위턱을 1X phosphate-buffered saline으로 희석한 4% 파라포름알데하이드 용액(pH7.4)으로 4℃에서 16시간 동안 고정하였고, 채취된 조직은 10% sucrose 용액으로 4℃에서 1일 동안 세척하였다. 조직절편을 제작하기 위해 일련의 탈수과정과 침투과정을 거쳐 치아의 시상단면을 관찰하기 위해 파라핀으로 포매하였고, 치배 및 치아의 발달에 대한 조직학적 관찰과 Bmp4의 발현을 확인하기 위해 5 μm 또는 12 μm 절편을 제작하였다.

2. H&E 염색

조직학적 관찰을 위해 5 μm 절편에서 파라핀을 제거하고 함수과정을 거친 후 gill’s hematoxylin (No. 3)으로 1분 30초 동안 염색하였고, 흐르는 물에서 5분 동안 세척한 다음, 0.2% alcoholic eosin으로 1분 20초 동안 염색하였고, 탈수와 투명과정을 거친 후 canada balsam으로 봉입하였다.

3. cRNA probe 제작 및 in situ hybridization

조직 내 Bmp4 mRNA를 확인하기 위해 미국 뉴욕대학교 치과대학의 Dr. Jean-Pierre Saint-Jeannet으로부터 제공된 pCDM8-Bmp4 plasmid를 제한효소 NotI을 처리한 다음, T7 polymerase를 이용하여 digoxigenin이 부착된 Bmp4 cRNA probe를 제작하였다. In situ hybridization 과정은 Cheng 등[14]의 방법에 따라 실시되었다.

Results

1. 조직학적 관찰

치아와 치배의 배열은 2열로 관찰되었다(Fig. 1). 첫째 열(입술 쪽)에서는 위턱뼈에 유착된 기능치아는 수평면과 수직방향이었고 위턱뼈에 유착되기 전의 기능전치아는 수직방향에 가까운 배열을 나타내었고, 치아의 모양은 혀 쪽으로 굽은 갈고리 형태로 관찰되었다(Fig. 1). 둘째 열에 배열된 계승치아 또는 치배는 첫째 열의 뒤쪽에서 구강상피와 이어져 있었고(Fig. 1), 계승치아 또는 치배의 발달 정도에 따라, 모자시기 (Fig. 1A and 1A′)와 종시기(Fig. 1B, 1B′, 1C, and 1C′), 광화시기 (Fig. 1D and 1D′)로 보였다. 종시기의 치배는 치아기질의 침착 정도에 따라 이른 시기(Fig. 1B and 1B′)와 늦은 시기(Fig. 1C and 1C′)로 구분되었고, 광화시기의 치배에서는 치아머리와 치아뿌리가 구분되었다.

모자시기의 치배에서는 납작한 바깥치아상피와 원주형의 안쪽치아상피, 납작한 별그물세포들, 밀집된 치아유두세포들로 구성되어 있었고, 안쪽치아상피와 치아유두세포 사이에는 무형질의 틈이 관찰되었다(Fig. 1A and 1A′).

이른 종시기의 치배에서는 치아상피와 치배의 바닥 쪽 치아유두세포들의 모양은 모자시기와 유사하였고, 치배의 꼭지 쪽에 배열된 치아유두세포는 원주형이었다. 치아상피와 치아유두세포 사이에서는 무형질의 간격이 관찰되었고, 치배의 꼭지 쪽에 배열된 치아유두세포들은 가는 돌기들이 무형질 쪽으로 돌출되었다(Fig. 1B and 1B′).

늦은 종시기에서는 미성숙된 법랑질과 상아질로 보이는 치아기질이 관찰되었고, 이에 안쪽치아상피를 법랑질모세포, 치아유두세포를 상아질모세포로 구분할 수 있다. 안쪽치아상피의 크기는 이른 종시기보다 증가되어 이 세포의 핵은 치아기질로부터 멀어져 별그물세포 쪽으로 놓여 있었고, 별그물세포층도 넓어졌다. 치배의 꼭지쪽에 놓인 상아질모 세포들은 서로 멀어져 있었다(Fig. 1C and 1C′).

광화시기의 치아기질은 법랑질과 enameloid, 상아질로 구분되었다. 법랑질은 ethylene-diamine-tetraacetic acid 용액에 의해 용해되어 빈 공간으로 보였고, 상아질은 상아질모세포와 이어져 있었다. Enameloid는 법랑질층 쪽으로 상아질의 표면층에 놓여있었고, 상아질 보다 어둡게 염색되었다. 상피세포층은 법랑질모세포와 뿌리집(Hertwig’s epithelial root sheath)세포로 구분되었다. 법랑질모세포의 크기는 교두 쪽에서 치아목쪽 방향으로 감소되었고, 뿌리집세포의 핵은 법랑질모세포보다 진하게 관찰되었다(Fig. 1D and 1D′).

위턱뼈에 유착된 기능치아는 맹출되어 구강쪽으로 돌출되었고 위 턱뼈에 유착되지 않은 기능전치아는 맹출되지 않은 상태로 관찰되었다. 기능치아는 기능시기(Fig. 1B, 1B′′, and 1B′′′)와 흡수시기(Fig. 1D, 1D′′, and 1D′′′)로 구분되었다. 기능시기에서는 상아질의 치수 쪽 표면에 잘 발달된 상아질모세포가 분포되었고, 흡수시기에서는 상아질의 치수 쪽에서 큰 다형핵세포들이 관찰되었다. 치수 내로 다수의 혈관들과 간질세포들이 분포되었다(Fig. 1B′′, 1B′′′, 1D′′, and 1D′′′).

2. Bmp4 의 발현

모자시기의 치배에서 Bmp4는 안쪽치아상피와 바깥치아상피, 별그물세포, 치아유두세포에서 발현되었고, 치배의 꼭지 쪽 치아유두세포에서 가장 강하게 발현되었다(Fig. 2A and 2A′). 종시기(Fig. 2B, 2B′, 2C, and 2C′)에서 광화시기(Fig. 2D and 2D′)로 발달되는 동안, Bmp4의 발현은 안쪽치아상피(법랑질모세포)와 별그물세포, 치아유두 세포(상아질모세포)에서 감소되거나 소실되지 않고 잘 유지되었다. 기능치아에서 Bmp4의 발현은 상아질모세포에서 강하게 관찰되었고, 법랑질모세포와 뿌리집세포에서는 그 발현 정도는 약간 감소된 상태였다 (Fig. 2E, 2E′, 2E′′, and 2E′′′).

Discussion

다생치 동물의 치아 발생에 관한 연구는 치배 발달과정에서 형태적으로 관찰되는 모든 시기(싹시기와 모자시기, 종시기, 광화시기)의 치배를 한 개체에서 확인할 수 있는 장점이 있다[4]. 본 연구에서 아프리카산 발톱개구리의 계승치아의 형성과 기능치아로 발달하는 과정에 대해 치배의 형태학적 특징과 Bmp4의 발현을 관찰하였다.

다생치의 치아 발생에 관한 연구는 파충류와 양서류, 어류의 치아에 대한 조직학적 구조와 미세구조에 대해서 보고되었고[3], 뱀의 치배는 중간엽으로 길게 자라나는 치아판의 형성으로 시작되었고, 치배와 치아의 형성은 치아판의 입술 쪽에 관찰되었다[9]. 도마뱀의 치배도 뱀과 유사하게 관찰되었다[12,13]. 송사리의 치배는 인두상피에서 인접한 부위에 형성되었다[10,11]. 본 연구에서 아프리카산 발톱개구리의 치배는 송사리와 유사하게 형성되었고, 이는 치아와 유착되는 턱뼈 사이에 결합조직층의 넓이와 관련이 있을 것이고, 치아의 크기와도 관련이 있을 것으로 추측된다.

치아 발생과정에서 다생치에서는 포유류의 치아와는 다른 enameloid가 형성된다[9-15]. Enameloid는 안쪽치아상피와 치아유두세포로부터 형성되는 이중기원으로 알려져 있고, 상아질보다 먼저 형성되는 것으로 보고되었다[13,15]. 법랑질은 enameloid의 표면에 형성되었고, 광화과정 중에는 enameloid는 상아질의 표면에서 놓여 있어 상아질과 구분되었으나, 광화과정이 완성된 후에는 enameloid와 상아질의 구분이 어려웠다[15]. 다생치에서 enameloid의 미세구조는 아교섬유로 구성되어 있었고, 이러한 구조적인 특징에 따라 EDTA로 탈회과 정을 거친 후에도 주로 계승치아 또는 턱뼈와 유착되기 이전의 치아에서 enameloid는 확인되었다[9-13,15]. 본 연구에서 계승치아의 상아질 표면에 enameloid의 침착은 상아질과 다른 염색상으로 관찰되었다. 생쥐의 치아에서 관찰되는 tomes 돌기[2]와 다생치 동물의 enameloid [13-15]는 치아 발생 초기에 형성되는 공통점이 있지만, 이들 구조들이 형성되기 위해 무엇이 작용하는지는 잘 알려져 있지 않고, 이에 다생치 동물에서 반복되는 치배를 대상으로 후속 연구가 필요할 것으로 생각된다.

치배의 형성은 치아기원판으로부터 시작되고, 이 부위에서 발현되는 Bmp4와 Pitx2, Shh는 치아형성띠표지인자로 알려져 있다[6,10]. 치아기원판에서 싹시기로 이행하는 과정에서 Pitx2 와 Shh 는 치아상피에 지속적으로 발현되는 반면에 Bmp4는 중간엽에서 발현된다[6]. 생쥐의 치아 발생과정 중 치배중간엽에서 Pax9의 발현은 FGF8에 의해 유도되는 반면, BMP4에 의해서는 억제되었다. 이로써 치배중간엽에서 BMP4는 FGF8의 억제인자(inhibitor)로 작용하는 것으로 알려졌다 [5]. 뱀의 치아판 발생과정에서 BMP4에 의해 Lef1의 발현이 증가되었고, cyclopamine을 처리하여 Hedgehog를 억제하였을 때 Bmp4의 발현이 증가되었다. 이로써 치아판형성 후 치아상피는 치배중간엽으로 부터 BMP4의 자극이 필요한 것으로 알려졌다[9]. 조류에서는 치아기 원판의 형성이 관찰되었으나 Bmp4의 발현은 확인되지 않았다[8]. 어류 중 테트라(tetra)에서는 구강과 인두 부위에서 치아가 관찰되었지만 송사리에서는 인두 부위에서만 치아가 확인되었다. 또한 테트라의 경우 구강과 인두의 치배에서 Bmp4가 발현되었으나, 송사리의 경우 Bmp4 가 인두 치배에서만 발현되고 구강 내에서는 발현되지 않았다. 이로써 치아발생 유무가 Bmp4의 발현과 밀접한 연관이 있을 것으로 보고되었다[10,11]. 본 연구에서 아프리카산 발톱개구리의 치아 발생과정에서 Bmp4의 발현은 모자시기부터 종시기, 광화시기로 구성된 계승치아와 기능치아에서 확인되었고, 이 발현은 치아상피와 법랑질모세포, 별그물조직, 치아유두세포, 상아질모세포, 뿌리집세포에서 관찰되었다. 이러한 결과로 보아 Bmp4는 아프리카산 발톱개구리의 치아 발생과정에서 중요한 역할을 할 것으로 생각된다. 후속 연구로서, Fgf8과 Pax9, Pitx2, Shh의 발현과의 비교뿐만 아니라 법랑질형성유전자와 상아질형성유전자, 뿌리집에서 발현되는 유전자와의 비교연구가 필요할 것으로 생각된다.