Introduction

구강질환은 전 세계적 중요한 건강 문제로, 일상생활에 영향을 미치며 높은 치료 비용과 지속적인 관리가 필요하다[1,2]. 구강질환은 흡연, 호르몬, 스트레스, 구강 위생 불량 등 여러 원인으로 인해 발병되며, 대표적인 구강질환으로 치주염(periodontitis)과 구강암이 있다[1,3].

최근 구강질환에 대한 연구는 골 면역(osteoimmunology)과 구강 미생물(oral microbiome)의 연관성을 바탕으로 진행되고 있다[4,5]. 치아에 음식물이나 침 등의 여러 물질들이 부착되고, 시간이 지나면 치석, 치태로 변하게 된다[6]. 이는 구강 내에 서식하고 있는 치주균이 증식하기 좋은 환경을 조성하여 치주염과 구강암 등 구강질환 발병 메커니즘을 작동시킨다고 알려져 있다[7].

구강 미생물은 음식 섭취와 호흡 등을 통해 구강 내에 형성되는 미생물 군집을 의미한다[4]. 그러나, 치주질환이나 감염성 질환에 의해 유익균과 유해균 간의 균형이 깨지면 구강질환뿐만 아니라 전신질환에도 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다[8]. 이에 따라 구강 미생물이 치주질환의 발병과 감염성 및 전신질환에 미치는 영향에 관한 연구의 중요성이 점차 부각되고 있다.

치주염은 치주균에 의해 발병되는 염증성 질환으로, 치주염의 원인균으로는 Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum; Fn), Tannerella forsythia, Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis; Pg) 등이 있다[3]. 대표적인 치주균 Pg는 만성 염증 유발을 통해 암의 발병에 기여한다고 알려져 있으며, 건강한 환자에 비해 구강편평상피세포암(oral squamous cell carcinoma, OSCC) 환자에서 치주균인 Pg가 많이 발견되기도 하였다[3,9]. 치주균 Pg의 세포벽 외막 구성 성분인 lipopolysaccharide (LPS)는 체내 면역 세포를 자극하여 tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β, IL-6 등의 사이토카인 및 nitric oxide 등 다양한 물질의 발현을 증가시키고, 이를 통해 염증성 질환인 치주염을 비롯하여 구강암과 같은 구강질환의 발병에 영향을 주는 것으로 알려져 있다[5,6].

치주 조직은 뼈의 형성과 파괴를 통한 골 항상성을 조절하는 골 대사(bone metabolism)가 일어나는 역동적인 조직으로, 새로운 뼈를 생성하는 조골세포(osteoblast)와 노화된 뼈를 흡수하는 파골세포(osteoclast) 간의 균형으로 유지된다[10,11]. 호르몬, 노화 등 여러 이유로 인해 조골세포와 파골세포 간의 불균형이 일어나게 되면, 골다공증, 다발성 골수종, 류마티스 관절염 등과 같은 흡수성 골 질환이 발병한다고 알려져 있다[11-13].

파골세포는 monocyte/macrophage lineage 세포로서, macrophage colony-stimulating factor(M-CSF)와 receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand (RANKL)에 의해 골 흡수에 관여하는 다핵형 세포이다[5,10,11]. 대표적인 osteoclastogenic 사이토 카인으로 RANKL, M-CSF, IL-6 등이 있으며, 이 중 RANKL은 파골 세포의 분화·생존·증식 등을 유도하는 대표적인 사이토카인이다[5]. 이에 반해 anti-osteoclastogenic 인자인 osteoprotegerin (OPG)은 RANKL의 decoy receptor로, 파골세포 분화 억제에 관여한다고 알려져 있다[5].

본 연구에서는 치주균인 Pg 유래 LPS(Pg-LPS)에 자극되어진 OSCC에서 osteoclastogenic factor 발현 변화를 확인하고, Pg-LPS에 자극된 OSCC로부터 수득한 조건 배양액(conditioned media, CM)이 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인함으로써, 치주질환과 구강 암의 발병 과정에 있어서의 치주균의 역할을 규명해 보고자 하였다.

Materials and Methods

1. Cell culture

본 실험에 사용한 OSCC cell lines인 Ca9-22, SCC-25 cells은 부산대학교 치의학전문대학원 구강병리학교실 유미현 교수에게 제공받았다. 이외의 HSC-3, YD-8 cells은 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank)에서 구매하여 사용하였다. Ca9-22, HSC-3, SCC-25 cells은 10% fetal bovine serum (FBS; Thermo Fisher Scientific), 1 × penicillin/streptomycin (P/S; Thermo Fisher Scientific)이 첨가된 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM; Welgene) 배지에서 배양되었다. YD-8 cells은 10% FBS, 1 × P/S, 300 mg/mL Lgulutamin 및 25 mM Hydroxyethyl piperazine Ethane Sulfonicacid (HEPES)가 첨가된 RPMI-1640 (Welgene) 배지를 사용하여 37℃, CO₂ incubator에 배양하였다.

2. Conditioned media

SCC-25 및 YD-8 cells의 CM을 수집하기 위해 100 mm dish 내에 약 80–100% confluence로 배양한 후 두 그룹으로 나누어 1 μg/ mL Pg-LPS (InvivoGen)를 첨가하거나(LPS CM), 첨가하지 않고(con CM) 24 hours 배양하였다. Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS; Welgene)을 이용하여 수세한 후, FBS가 포함되지 않은 기본 배지로 교체하여 24 hours 추가 배양하였다. 다음 날, 두 그룹의 배양액을 각각 모아서 원심분리한 후 상층액을 모아 0.45 μm filter(GE Healthcare)로 필터한 후 소량씩 분주하여 –80℃에 보관하였다.

3. Bone marrow-derived macrophages isolation and osteoclast differentiation

Bone marrow-derived macrophages (BMMs) 분리를 위하여 5 주령 ICR mouse에서 경골 및 대퇴골을 추출한 후 뼈 양쪽 끝을 절단하고 α-MEM (Welgene) 배지가 담겨있는 주사기를 이용하여 골수 조직을 세척(flushing)하여 모아주었다. ACK buffer (Qiagen)를 이용하여 red blood cells을 용해한 후 α-MEM 배지를 첨가하여 배양하였다. 3일 후 부유세포를 회수하여 원심분리한 후, 30 ng/mL rhM-CSF (PeproTech)가 포함된 α-MEM 배지에 3일간 추가로 배양한 후 실험에 사용하였다. 파골세포 분화를 위하여 48 well plate에 30 ng/mL M-CSF가 포함된 배지를 이용하여 BMMs를 seeding한 후 24 hours 배양하였다. 100 ng/mL sRANKL (Prospec Biotec), 30 ng/mL M-CSF가 포함된 배지로 2일간 배양한 후, 두 그룹으로 나누어 con CM 및 LPS CM이 포함된 배지로 2일간 추가 배양하였다.

실험은 부산대학교 동물실험윤리위원회(PNU-2024-0434)의 윤리 규정에 따라 실험하였다.

4. RNA extraction and quantitative reverse transcription polymerase chain reaction

세포에서 RNeasy mini kit (Qiagen)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 Total RNA를 분리하였다. 분리한 RNA에 각 dNTP Mix, Oligo (dT) primer, Maxima H Minus Reverse Transcriptase (Thermo Fisher Scientific)를 혼합하고 polymerase chain reaction(PCR) 기기를 이용하여 cDNA를 합성하였다. PCR amplification은 cDNA, primer, SYBR green qPCR kit (Enzynomics)를 사용하였으며, AB 7500 Fast Real-time PCR system(Applied Biosystems)을 이용하여 분석하였다. PCR 조건으로는 95℃에서 10 minutes 동안 initial denaturation step을 거치고, 95℃에서 15 seconds 간 denaturation, 60℃에서 15 seconds 간 annealing, 72℃에서 20 seconds 간 extension의 과정을 40회 반복하였다. 각 genes 발현양은 2 ^{–Δ ΔCT} method를 이용하였으며, 내인성 대조군 유전자인 Actin Beta (ACTB)를 사용하여 상대 정량을 실시하였다. 본 실험에 사용한 유전자에 대한 primer는 Table 1에 나타내었다.

5. Tartrate-resistant acid phosphatase staining

Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining kit (Sigma-Aldrich)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 염색하였다. 4% formaldehyde를 처리하여 세포를 고정한 후, 0.1% Triton X-100을 처리하였다. 증류수로 3회 수세한 후, 염색 시약을 처리하고 37℃ incubator에서 1 hour 반응시키고, 3회 수세한 후 현미경으로 관찰하였다. 3개 이상의 핵을 포함하고 있는 TRAP 양성 다핵세포(multinucleated cells, MNCs)를 계수하였으며, 이는 ImageJ를 이용하여 정량화 하였다.

6. Cell proliferation assay

Cisplatin과 5-fluorouracil(5-FU; Selleckchem)에 대한 half maximal inhibitory concentration(IC₅₀) 및 Pg-LPS 처리에 따른 cell proliferation을 측정하기 위해 cell counting kit (CCK)- 8 (Dojindo)를 사용하였다. 96 well plate에 1 × 10⁴ cells/well 을 seeding한 후, 다양한 농도의 cisplatin과 5-FU가 포함된 배지에 Pg-LPS를 처리하거나 처리하지 않고 배양하였다. 24 hours 혹은 48 hours 후에 CCK-8 시약을 첨가하고 1 hours 추가 배양한 후 450nm 에서 흡광도를 측정하였다.

7. Statistical analysis

본 실험 결과는 평균 ± 표준오차로 표시하였다. 두 그룹 간의 차이는 Student의 t-검정을 사용하여 비교하였으며, 다중 비교를 위해 Bonferroni 사후검정을 사용한 일원(one-way) 또는 이원(two-way) 분산 분석(ANOVA)이 사용되었다. 통계적 유의성은 p ＜ 0.05로 나타내었다.

Results

1. Pg-LPS가 OSCC의 RANKL 발현에 미치는 영향

다양한 OSCC 세포주에서 발현하는 파골세포 분화물질 RANKL 수준을 확인하기 위해, Ca9-22, HSC-3, SCC-25, YD-8 cells에서 RANKL mRNA 발현양을 quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (RT-qPCR)을 이용하여 확인하였다. RANKL 발현 양은 HSC-3 cells에서 통계적으로 유의미한 수준으로 가장 높게 나타나는 것으로 확인되었다(Fig. 1A). 다음으로, 치주질환의 주요 원인균인 Pg가 분비하는 독성인자 Pg-LPS를 24 hours 처리한 후, 각 세포별의 RANKL mRNA 발현 양 변화를 확인하였다. Ca9-22, SCC-25, YD-8 cells은 control에 비해 Pg-LPS 처리군에서 RANKL mRNA 발현 양이 통계적으로 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. 이에 반해 HSC-3 cells에서는 Pg-LPS 처리 시, RANKL mRNA 발현 양이 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 1B).

Pg-LPS 처리 시 RANKL mRNA 발현이 높았던 SCC-25, YD-8 cells에서 Pg-LPS 시간별 처리에 따른 RANKL mRNA 발현 양을 확인하고자 하였다. Pg-LPS를 처리하고 24 hours의 간격으로 72 hours 동안 관찰하였을 때, 24 hours이 경과 후, control에 비해 RANKL mRNA 발현 양이 가장 높게 나타났다(Fig. 1C and 1D). 본 결과는 Pg-LPS가 구강암 세포주의 RANKL 발현을 증가시킨다는 사실을 제시한다.

2. Pg-LPS가 SCC-25, YD-8 cells의 M-CSF, OPG, IL-6 발현에 미치는 효과

Pg-LPS에 자극된 SCC-25, YD-8 cells에서 RANKL 외 파골세포 분화 관련 인자인 M-CSF, OPG, IL-6 발현에 미치는 효과를 확인하고 자 하였다. SCC-25, YD-8 cells에서 Pg-LPS를 24 hours 처리한 후, RT-qPCR을 이용하여 M-CSF, OPG, IL-6 mRNA 발현 양을 확인하였다. SCC-25 cells에서 M-CSF와 IL-6 mRNA 발현 양은 Pg-LPS 처리군에서 control에 비해 유의적으로 감소하였으나, OPG mRNA 발현 양에서 control에 비해 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 2A–2C).

YD-8 cells에서는 M-CSF mRNA 발현 양이 control과 Pg-LPS 처리군 간에 차이가 없는 것을 확인하였다. OPG mRNA 발현 양에서는 control에 비해 Pg-LPS 처리군에서 유의적으로 감소하였으나, IL-6 mRNA 발현은 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다(Fig. 2D–2F). 이에 따라 SCC-25, YD-8 cells에서 Pg-LPS를 처리하였을 시, 파골세포 분화 인자인 RANKL mRNA 발현뿐만 아니라 M-CSF, OPG, IL-6 mRNA 발현에도 영향을 미치는 것을 확인하였다.

3. Pg-LPS가 SCC-25, YD-8 cells의 cisplatin, 5-FU 항암제 민감성에 미치는 효과

SCC-25, YD-8 cells에 Pg-LPS를 24 hours 혹은 48 hours 처리한 후, 세포의 증식을 CCK-8 assay를 통해 확인하였다. SCC-25, YD-8 cells 두 처리군 모두에서 세포 증식에 대한 Pg-LPS의 유의미한 영향은 관찰되지 않았다(Fig. 3A and 3D).

Pg-LPS에 자극되어진 SCC-25, YD-8 cells에 항암제인 cisplatin 과 5-FU가 미치는 항암제 민감성을 확인하기 위해, 다양한 농도의 cisplatin과 5-FU를 처리한 후 CCK-8 assay를 통하여 IC₅₀을 확인하였다. SCC-25 cells에서 각 cisplatin, 5-FU에 대한 IC₅₀은, control 에서 3.81 μM, 4.16 μM, Pg-LPS 처리군에서 3.53 μM, 4.31 μM인 것을 확인하였다(Fig. 3B and 3C). YD-8 cells에서 각각 cisplatin, 5-FU를 농도별 처리 후, IC₅₀을 확인한 결과, control에서 4.53 μM, 4.03 μM, Pg-LPS를 처리하였을 시, 3.80 μM, 4.04 μM로 확인하였다(Fig. 3E and 3F). 추가적으로, control에 비해 Pg-LPS 농도 0.3 μM와 1 μM 처리군에서 cisplatin에 대한 생존율이 유의적으로 감소됨을 확인하였다.

4. Pg-LPS에 의해 자극되어진 SCC-25, YD-8 cells이 파골 세포 분화에 미치는 효과

Pg-LPS에 의해 자극되어진 SCC-25, YD-8 cells이 파골세포 분화에 미치는 영향을 확인하고자, SCC-25, YD-8 cells에 Pg-LPS를 처리하지 않거나(con CM) 혹은 처리한(LPS CM) 후 세포 CM을 수득 하였다. 그 다음 BMMs를 파골세포로 분화하는 과정 중에 각각의 CM 을 첨가하여 TRAP staining을 통해 파골세포 분화에 CM의 영향을 확인하였다. TRAP staining을 통해 파골세포 분화 여부를 확인한 결과, positive control인 M-CSF+RANKL 처리군에서 파골세포가 분화된 것을 확인하였다(Fig. 4B). YD-8 con CM과 LPS CM 간의 TRAP 염색 여부를 확인한 결과, M-CSF+RANKL 처리군과 YD-8 con CM에 비해 YD-8 LPS CM의 TRAP 양성 MNCs(TRAP⁺MNCs) 수가 증가하는 유의성을 나타내었다. 하지만, TRAP 양성 MNCs의 면적을 확인하였을 시, YD-8 cells에서는 con CM과 LPS CM 간의 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 4C). SCC-25 cells의 경우 con CM과 LPS CM에 서 M-CSF+RANKL 처리군에 비해 TRAP 양성 MNCs의 수가 유의적으로 증가하는 것을 확인하였고, SCC-25 LPS CM 처리군에서 TRAP 양성 MNCs의 면적이 M-CSF+RANKL 처리군에 비해 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 하지만, SCC-25 con CM과 SCC-25 LPS CM 간의 TRAP 양성 MNCs 수와 면적의 유의적인 차이는 없었다(Fig. 4C and 4D). 따라서 본 결과는, Pg-LPS 처리에 따른 SCC-25와 YD-8 cells은 국소 분비 기전을 통하여 파골세포의 수와 크기의 형성에 영향을 미칠 수 있다는 사실을 시사한다.

Discussion

사람의 구강에는 약 700종 이상의 미생물이 군집하고 있다. 구강 내 미생물과 여러 요인으로 인해 염증성 장 질환, 구강암, 췌장암, 당뇨병, 치주질환 등 여러 질병의 발병에 밀접하게 연관되어 있다고 보고된다 [14]. 구강 내 미생물과 여러 질병의 직접적인 연관성에 대한 연구가 진행되고 있지만, 치주균에 자극된 OSCC가 분비하는 osteoclastogenic 인자 변화와 치주균인 Pg-LPS에 자극된 OSCC의 CM이 파골세포 분화에 미치는 영향에 대한 연구는 아직 알려져 있지 않다.

치주질환은 구강 내 만성 염증 및 골 소실을 초래하는데, 치주균인 Pg 와 Fn에 감염된 치주질환 환자는 OSCC와 밀접한 관련이 있다고 알려져 있으며[15,16], 염증성 사이토카인, matrix metalloproteinases, RANKL과 같은 질병의 발전과 관련 있는 물질들의 발현 또한 두 질병 사이에서 비슷하게 나타난다고 알려져 있다[17,18].

Pg-LPS는 bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) 의 exosome 내 RANKL의 발현을 유의적으로 증가시키는 것으로 보고되었다. Pg-LPS를 처리하여 수득한 BMSCs 유래 exosome이 RAW264.7의 TRAP 양성 MNCs 형성을 증가시켰다[19]. 이 결과는 Pg-LPS에 의해 증가된 exosome 내 RANKL의 발현이 파골세포의 분화를 증가시킬 수 있다는 사실을 제시하며, 본 연구에서 제시한 Pg- LPS가 RANKL의 발현을 통하여 OSCC가 파골세포의 분화를 촉진시 킬 수 있다는 결과와 일치한다.

두경부암세포주인 UM-SCC cells의 이식은 동물 모델에서 RANKL의 발현을 통하여 파골세포의 활성을 증가시켰고, 이를 통해 골 용해성 뼈 소실을 유도할 수 있다는 결과가 보고되었다[20]. 이는 본 연구에서 사용한 OSCC가 RANKL의 발현을 통해서 파골세포의 활성으로 치주 질환의 발달을 자극시킬 수 있을 것이라는 가능성을 뒷받침한다.

RANK/RANKL/OPG pathway는 골 형성과 골 소실의 균형인 골 항상성에 주요 신호 전달기전이다[5,21,22]. 조골세포에서 발현되는 RANKL은 조골세포 분화 및 성장의 주요 조절인자로 알려져 있으며, RANKL의 receptor인 RANK와 결합을 통해 파골세포의 성숙을 유도한다고 알려져 있다[21]. RANKL/RANK/OPG pathway는 구강암에서 전이에 관여한다고 알려져 있으며, 구강암의 전이 과정 중 치주 질환으로 인한 해당 신호기전의 활성은 파골세포의 형성을 통해 암세포가 뼈로 침윤되는 것을 돕는 것으로 보고됐다[8]. 따라서, 치주균 Pg에 자극되어진 OSCC의 RANKL 신호기전은 파골세포 분화를 촉진시키고 이를 통해 암세포의 전이를 증가시킴으로써 양성 피드백(positive feedback)을 통하여 구강암과 치주질환이 서로 발달될 수 있을 가능성을 시사한다.

IL-6는 조골세포에서 RANKL 발현 촉진 및 파골세포와 조골세포의 분화를 조절함으로써 골 항상성, 면역반응 등에 다양한 기능을 하는 사이토카인으로 알려져 있다[23,24]. 하지만, IL-6는 염증을 촉진하는 사이토카인으로, 류마티스 관절염, 골다공증과 같은 골 소실과 관련된 질병에서 발현 수준이 높게 나타나는 것으로 보고됐으며[22-24], IL-6 및 IL-6 receptor를 타깃으로 하는 tocilizumab, sarilumab, olokizumab이 골 소실성 질환 치료제로 승인되었다[24,25]. 본 연구에서 YD-8에 Pg-LPS를 처리하였을 시, IL-6 발현 양이 유의적으로 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 Pg-LPS에 의한 OSCC 내 IL-6 발현 증가는 생체 내에서 치주질환으로 인한 구강암 세포의 IL-6 발현을 증가 시킬 수 있으며, 증가된 IL-6의 발현이 치주질환을 비롯한 류마티스 관절염 등과 같은 염증성 골 소실성 질환 발병에 영향을 줄 수 있을 가능성을 시사하며, 본 가능성에 대해서는 추가적인 실험을 통한 검증이 필요할 것으로 생각된다.

본 연구는 치주균 유래 독성인자인 Pg-LPS에 의해 파골세포 분화 조절인자 RANKL이 OSCC 내에서 증가될 수 있으며, 증가된 RANKL 이 파골세포의 형성 촉진을 통해서 치주질환의 발달에 기여할 수 있다는 사실을 제시한다. 본 결과는 질병 발달 과정에 있어서의 치주질환과 구강암의 새로운 상관관계를 규명하였으며, 치주질환 및 구강암 치료를 위한 전략 개발에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.