Search
Contact Us
HOME

  • Crossref logo
  • Crossref Similarity Check logo
Journal Search Engine

to

Search Advanced Search Adode Reader(link)
Download PDF Export Citaion korean bibliography PMC previewer
ISSN : 1226-7155(Print)
ISSN : 2287-6618(Online)
International Journal of Oral Biology Vol.50 No.2 pp.64-73
DOI : https://doi.org/10.11620/IJOB.2025.50.2.64

Antioxidative and anti-inflammatory effects of the ethanol extract of Salvia plebeia R. Br. on human gingival fibroblast cells

Hyeonjun Cho1,2, Chaekwang Rim1, Joong-Ki Kook2,3*
1RCK Co., Ltd. Research Institute, Hwasun 58141, Republic of Korea
2Department of Oral Biochemistry, School of Dentistry, Chosun University, Gwangju 61452, Republic of Korea
3Oral Bacterial Pathogen Resource Specialized Bank and Korean Collection for Oral Microbiology, Chosun University, Gwangju 61452,
Republic of Korea
*Correspondence to:: Joong-Ki Kook, E-mail: jkkook@chosun.ac.krhttps://orcid.org/0000-0003-2628-2870
April 15, 2025 May 28, 2025 May 29, 2025

Abstract


Periodontitis is a chronic inflammatory condition primarily triggered by bacterial infections, with periodontopathogens such as Porphyromonas gingivalis playing a pivotal role. We evaluated the antioxidant and anti-inflammatory effects of ethanol extract of Salvia plebeia R. Br. (SP-E) on human gingival fibroblasts (hTERT-hNOF) stimulated with P. gingivalis -derived lipopolysaccharide (LPS). Dried S. plebeia was extracted using 70% ethanol, yielding a 10.5% extract. Inflammation in hTERT-hNOF cells was induced using P. gingivalis LPS in conjunction with LPS-binding protein and CD14. SP-E was administered at concentrations ranging from 25 to 100 μg/mL. Antioxidant capacity was measured using the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) assay and superoxide dismutase (SOD) activity assay. Inflammatory cytokine expression and secretion were analyzed via reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), respectively. Results demonstrated a concentrationdependent antioxidant effect, with 62.98% radical scavenging activity observed at 200 μg/mL SP-E. In hTERT-hNOF cells, SOD activity increased from 4.88% (LPS-treated) to 45.78% with 100 μg/mL SP-E. RT-PCR analysis showed significant downregulation of interleukin (IL)-1β, IL-6, and IL-8 mRNA expression following SP-E treatment. ELISA confirmed a reduction in tumor necrosis factor (TNF)-α (312.83 → 178.22 pg/mL), IL-6 (453.97 → 170.83 pg/mL), and IL-8 (480.14 → 276.86 pg/mL) levels with 100 μg/mL SP-E. These findings suggest that SP-E may offer therapeutic potential for preventing and managing periodontal disease by mitigating oxidative stress and modulating inflammatory cytokine expression. Further studies are warranted to elucidate the underlying molecular mechanisms and validate these effects in vivo .


Anti-inflammatory agents , Antioxidants , Cytokines , Periodontal diseases , Salvia plebeia R. Br.

초록

    © The Korean Academy of Oral Biology. All rights reserved.

    This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/bync/4.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

    Introduction

    염증은 열, 화학적 손상, 미생물 감염 등 다양한 종류의 자극에 대한 생리적 반응으로, 손상된 조직을 복구하기 위한 방어 및 재생 과정이다 [1-4]. 정상적인 염증 반응은 병원체나 독소 등 외부 위협으로부터 신 체를 보호하지만, 과도하게 반복적으로 발생하거나 적절히 조절되지 않 은 염증은 오히려 조직 손상을 일으킬 수 있다.

    염증은 산화 스트레스와 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 염 증 초기 단계에서 생성되는 사이토카인은 과산화물(superoxide) 생성 을 촉진하며, 이로 인해 산화적 손상이 발생한다. 여러 연구에 따르면 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 mitogen-activated protein kinase (MAPK) 신호 전달 경로를 통하여 염증 반응을 유도 하며, 이 과정에서 염증성 사이토카인 생성이 촉진된다[5,6]. 염증 반 응 중 세포 내에서 생성되는 주요 사이토카인으로는 tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-8 등이 있으며, 이 외에도 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase- 2 (Cox-2)와 같은 염증 관련 효소들이 관여한다[1,5,7,8].

    치은 섬유아세포(human gingival fibroblast, HGF)는 면역 조절 및 염증 반응에서 중요한 역할을 수행한다[9]. 구강 내 그람 음성 세균 종 의 LPS는 인체 및 세포에서 염증 반응을 유발하는 주요 물질로 알려져 있으며, 특히 Porphyromonas gingivalis는 치주질환의 주요 원인균으 로, 감염 시 다양한 치주질환을 촉발할 수 있다[9-13]. 이 균의 LPS는 HGF와 같은 다양한 세포에서 염증 매개물질의 생성을 유도하며, 일련 의 염증 반응을 촉진하는 역할을 한다[13-15].

    배암차즈기(Salvia plebeia R. Br.)는 우리나라를 비롯해 중국, 인도, 이란, 호주 등 여러 국가에서 자생하는 꿀풀과의 이년생 초본이다. 이 식물은 설견초, 곰보배추, 뱀배추라는 이명을 가지고 있으며, 예로부터 민간에서 기침, 천식, 염증 등에 효능이 있다고 알려져 치료에 사용되 어 왔다[16-19]. 배암차즈기의 주요 성분으로는 플라보노이드(flavonoids), 폴리페놀(polyphenols), 모노터페노이드(monoterpenoids), 사포닌(saponins) 등 93종 이상의 화합물이 포함되어 있으며, 주요 약 리학적 성분으로는 로즈마린산(rosmarinic acid), 루테올린(luteolin), 네페틴(nepetin), 히스피둘린(hispidulin), 카페인산(caffeic acid) 등 의 성분이 함유되어 있다[16,18-20]. 이들 성분은 항산화, 항균, 혈당 강하, 항염증, 진통, 피부 진정, 항바이러스 등 다양한 효능이 있는 것으 로 보고되고 있다[16,17,20,21].

    배암차즈기 추출물이 항산화, 항균 등의 효과를 가지며, 대식세포에서 LPS 자극에 의한 항염증 효과가 있다는 연구가 보고된 바 있다[1,20]. 그러나 치주염 및 치주질환과 관련된 염증에 대한 효능을 조사한 연구 는 아직까지 이루어지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 치주질환 원인 균인 P. gingivalis에서 유래한 LPS를 투여한 HGF에서의 배암차즈기 추출물의 항염증 및 항산화 효능을 평가하고자 하였다.

    Materials and Methods

    1. Preparation of natural extract

    추출 원료로는 전라북도 부안에서 채취된 배암차즈기를 부안 동진농 원에서 구매하여 사용하였다. 추출 방법은 Fig. 1에 제시된 바와 같이, 건조된 배암차즈기의 이물질을 제거한 후, 3 cm 이하 크기로 분쇄하여 70% 에탄올을 20배량 첨가한 후 상온에서 5일간 반응시키는 방식으 로 추출하였다. 반응 후에는 paper filter (Whatman)를 이용해 두 차 례 여과하여 원물 및 이물질을 제거하였다. 이후 여과액을 42–45℃, 50–70 rpm 조건에서 회전 감압 농축(evaporation)하였으며, 최종적 으로 동결 건조된 추출 파우더는 100% dimethyl sulfoxide (DMSO) 에 녹인 후 실험 농도에 맞추어 배양액으로 희석하여 사용하였다.

    2. Preparation of LPS

    P. gingivalis 유래 LPS (Pg-LPS)는 P. gingivalis KCOM 2804 균 주에서 추출하여 실험에 사용하였다. LPS 추출은 LPS Extraction Kit (iNtRON Biotechnology)를 사용하여 제조회사에서 소개한 방법대로 추출하였으며, 추출된 Pg-LPS는 0.22 μm 주사기 필터로 여과한 후 멸균수에 녹였고, 동결 건조하여 파우더 형태로 만든 뒤 정량하여 다음 시험에 사용하였다.

    3. Cell culture

    본 연구에서는 사람 유래 HGF인 hTERT-hNOF 세포주를 사용하였 다. hTERT-hNOF 세포는 연세대학교 구강병리학 교실 김진 교수님 으로부터 분양받아 사용하였다. hTERT-hNOF 세포는 DMEM/F12 (Welgene) 배지에 10% fetal bovine serum (Atlas Biologicals, Inc.), 1% penicillin/streptomycin (GIBCO)을 첨가하여 배양하였다. 모든 세포는 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 또한, 이들 세포는 2–3일마다 계대 배양을 진행한 뒤 실험에 활용하였다.

    4. Cell cytotoxicy measurement

    충분히 배양된 hTERT-hNOF 세포는 96 well plate에 각각 3 × 104 cells/well로 접종하고 24시간 배양하였다. 이후, 배암차즈기 에 탄올 추출물(S. plebeia R. Br. ethanol extract, SP-E)을 농도별(25, 50, 100, 200 μg/mL)로 처리하고 37℃, 5% CO2 조건의 incubator (SCA-165DS; Astec)에서 24시간 더 배양한 후 현미경으로 세포를 육안으로 확인한 후 EZ-Cytox (DoGenBio)를 처리하여 세포 생존율 을 확인하였다. EZ-Cytox는 well 당 10 μL씩 멀티 파이펫을 활용하 여 넣어주고 3–4시간 세포 배양기에 추가 배양을 진행하였다. 추가 배 양 후 1분 동안 교반하고, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) reader (Epoch; BioTek Instrument Inc.)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

    세포 생존율은 다음 공식으로 계산하였다.

    Cell viability (%) = (1 – sample treated group optical density [OD] / control group [vehicle control with 0.1% DMSO] OD) × 100.

    5. Radical scavenging capacity measurement

    Radical 소거능은 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼 소거활성 분석을 이용하여 측정하였다. SP-E를 농도별(25, 50, 100 μg/mL)로 희석하여 녹인 후 100 μL를 96 well plate에 넣어주고 0.2 mM DPPH (Sigma-Aldrich) 용액을 사용하기 전에 제조하여 100 μL 를 추가한 후, 상온에서 30분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, ELISA reader (Epoch)를 이용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.

    DPPH radical 소거능은 = (1 – sample treated group OD / control group OD) × 100으로 계산하였다.

    6. Assessment of superoxide dismutase activity

    hTERT-hNOF 세포를 48 well plate에 4.5 × 104 cells/well로 접종하였다. 이후 Pg-LPS 200 ng/mL, CD14 200 ng/mL와 LBP 50 ng/mL를 함께 처리하여 충분한 염증 반응을 유도하였다. 1시간 경 과 후, SP-E를 처리하고 24시간 동안 배양을 진행하였다. 세포 배양 은 37℃, 5% CO2 조건의 incubator (SCA-165DS)에서 배양하였다. 배양 후, 세포 배양액을 회수하여 superoxide dismutase (SOD) kit (EZ-SOD assay kit; DoGenBio)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따 라 분석을 진행하였다. Pg-LPS와 SP-E를 농도별(25, 50, 100 μg/ mL)로 처리하고 배양한 세포 배양액 30 μL에 soluble tetrazolium salt solution 200 μL와 enzyme solution 2 μL를 96 well plate에서 37℃에서 20분간 충분히 반응시킨 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하 고 SOD의 활성도를 계산하였다.

    7. mRNA expression changes of pro-inflammatory cytokines

    염증성 사이토카인의 mRNA 수준에서 발현 양상을 확인하기 위하여 hTERT-hNOF 세포를 6-well plate에 5 × 105 cells/well로 접종하 여 배양한 뒤, Pg-LPS 200 ng/mL, CD14 200 ng/mL 및 LBP 50 ng/mL를 처리하고, 이어서 SP-E를 농도별로 처리하여 2시간, 4시간 동안 추가 배양하였다.

    배양 후, 세포가 떨어지지 않도록 조심히 상등액을 제거하고 D-PBS (Welgene)로 3회 이상 충분히 세척한 다음, RNA Extraction Kit (Bioneer)를 사용하여 세포에서 RNA를 추출하여 사용하였다. 추출된 RNA는 NanoDrop (Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 정량하여 사용하였으며, 이후 RT PreMix Kit (Bioneer)를 이용하여 cDNA를 합 성하였다. cDNA 합성은 PreMix Kit에 정량의 RNA를 넣어주고 25℃ 에서 5분, 42℃에서 60분, 72℃에서 15분 동안 반응을 진행하였다.

    Polymerase chain reaction (PCR) 진행을 위한 항염 관련 사이토 카인 유전자 증폭을 위한 프라이머의 염기서열은 Table 1과 같았으며, 이는 Bioneer에 의뢰하여 제작하였다. PCR은 PCR PreMix (Bioneer) 를 이용하여 진행하였다. PCR은 94℃에서 30초(denaturation), 50–53℃에서 30초(annealing), 72℃에서 40초(extension)로 진행하 였다. Annealing 온도는 IL-1β, IL-6, TNF-α는 53℃, IL-8은 50℃ 로 반응을 진행하였다(Table 1). PCR 이후 0.8% 아가로스 젤에 전기 영동하여 PCR 증폭물을 확인하였다.

    8. Protein expression changes of pro-inflammatory cytokines

    분비되는 염증성 사이토카인 단백질 발현 변화를 측정하기 위해 ELISA 법을 이용하여 확인하였다. IL-1β, TNF-α 및 IL-6 측정을 위한 키 트는 BioLegend에서, IL-8을 측정하기 위한 키트는 Elabscience에 서 구매하여, 각각의 제조회사에서 설명한 방법을 이용하여 측정하였 다. 이를 간략히 설명하자면, hTERT-hNOF 세포를 12-well plate에 3 × 105 cells/well로 접종하고 배양한 후, Pg-LPS 200 ng/mL를 처리하고 충분한 염증 반응 유도를 위하여 CD14 200 ng/mL 및 LBP 50 ng/mL를 처리하였다. 이후 SP-E를 농도별로 처리하고 24시간 동 안, 이들 세포를 배양하였다. 24시간 배양 후, plate에서 배양된 배지를 수거하여 tube에 옮긴 뒤 20분 동안 1,000 × g, 4℃에서 원심분리를 진행하였다. TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-8의 사이토카인 키트의 코팅 된 plate에 세포 배양액을 50–100 μL씩 넣어주어 반응 후, washing 을 해준 후 detect-Ab, HRP-conjugated와 reagent를 차례로 반응 시킨 후 ELISA reader (Epoch)를 이용하여 이들 사이토카인의 단백질 발현량을 측정하였다.

    Results

    1. Extraction yield of SP-E

    부안산 배암차즈기 에탄올 추출, 감압 농축, 동결건조 과정을 통해 최 종적으로 추출 파우더를 확보하였으며, 40 g의 원물로부터 약 4.22 g 의 추출물이 얻어져 추출 효율은 10.5%에 달하는 것으로 나타났다.

    2. Cytotoxicity of SP-E

    세포 독성 평가를 위해 hTERT-hNOF 세포에 SP-E를 50–200 μg/ mL 농도로 처리한 후, EZ-Cytox assay를 통해 세포 독성을 측정한 결 과, 모든 군에 94% 이상의 세포 생존을 보여 세포 독성은 없는 것으로 판단되었다(Fig. 2). 다만, SP-E를 200 μg/mL 농도로 처리한 후 육안 으로 관찰한 결과, 세포 모양이 약간 불규칙한 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로, 이후 실험에서는 SP-E 100 μg/mL 이하 농 도(25, 50, 100 μg/mL)에서 실험을 진행하였다.

    3. Antioxidant activity of SP-E

    ROS는 인체 내에서 다양한 독성을 유발하고 세포 손상, 염증 및 여 러 질병의 발병에 기여하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 DPPH assay를 이용하여 SP-E의 자유 라디칼 소거능을 측정하였다. 자유 라 디칼 소거능을 비교하기 위해 양성 대조군으로 L-ascorbic acid를 사 용하였다. Fig. 3에 나타난 바와 같이, L-ascorbic acid는 25 μg/mL 농도에서 37.91%의 자유 라디칼 소거 능력을 나타냈으며, 농도가 증가 함에 따라 소거 능력도 유의미하게 상승하여 100 μg/mL에서 76.45% 의 높은 소거 능력을 나타냈다. SP-E 처리군을 확인한 결과 양성 대조 군에 비해 자유 라디칼 소거 능력이 다소 낮게 측정되었으나, 각 농도에 서 소거 능력이 점진적으로 증가하는 경향을 보였다. 각 농도별 SP-E 의 소거 능력을 확인해 본 결과 25 μg/mL에서 20.81%, 50 μg/mL에 서 32.25%, 100 μg/mL에서 49.22%로 측정되어, SP-E가 농도 의 존적으로 라디칼 소거능을 가지고 있음을 확인하였다.

    hTERT-hNOF 세포에서의 SOD 효소 활성을 측정한 결과는 Fig. 4 에 제시하였다. 무처리군의 SOD 활성은 27.08%였으나, SP-E를 단독 으로 처리한 경우 SOD 활성이 48.54%로 증가하여 무처리군보다 유의 미하게 높은 활성을 나타냈다. 그러나 LPS로 자극을 준 경우 SOD 활 성은 4.88%로 크게 저하되었는데, 이는 LPS가 산화적 스트레스를 유 발하여 SOD 기능을 억제함을 시사한다.

    LPS와 SP-E를 동시에 처리한 경우 SOD 활성의 회복이 관찰되었으 며, 특히 SP-E의 처리 농도에 따라 활성이 증가하는 양상을 보였다. 25 μg/mL에서 37.00%, 50 μg/mL에서 41.97%, 100 μg/mL에서는 45.78%의 활성을 보여 무처리군 이상의 수준으로 회복됨을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 SP-E가 SOD의 활성을 증진시키는 데 기여함 을 보여준다. DPPH를 활용한 라디칼 소거능 및 SOD 활성 증진을 통 해 SP-E가 항산화능을 가지고 있음을 확인하였다.

    4. Inhibitory effect of SP-E on mRNA expression of pro-inflammatory cytokines

    감염이나 다양한 자극에 의해 생체 내에서 염증 반응이 유도되며, 이 과정에서 다양한 사이토카인이 분비된다. 본 연구에서는 SP-E가 사이 토카인 mRNA 발현에 미치는 영향을 평가하기 위해, hTERT-hNOF 에서 주요 구강 병원균인 Pg-LPS, CD14 및 LBP를 이용하여 염증 반 응을 유도한 후 SP-E를 처리하여 주요 사이토카인의 유전자 발현 변 화를 분석한 결과는 Fig. 5에 제시하였다. PCR의 결과는 아가로스 젤 에 전기영동을 진행한 후 PCR 증폭물 밴드의 밀도를 ImageJ 프로그램 (National Institutes of Health)을 이용해 정량 분석하여 확인하였다.

    hTRERT-hNOF 세포에 LPS, CD14 및 LBP 처리를 통해 염증 반 응이 유도됨에 따라 IL-1β와 IL-8의 유전자 발현이 급격히 증가하였으 나, SP-E를 처리한 경우 이러한 발현 증가가 억제되는 양상이 나타났 다. IL-1β의 경우, LPS 처리 후 2시간 반응 시 유전자 발현을 기준으로, SP-E 100 μg/mL 처리 시 34.00%로 감소하였고, 4시간 반응에서 는 10.11%로 현저히 감소하였다. IL-8은 2시간 반응에서 SP-E 처리 후 2.57%로 감소하였으며, 4시간 반응에서도 3.90%로 유사한 감소 양상을 보였다. 한편, IL-6의 발현은 염증 유도 후 뚜렷한 증가를 보였 으나, SP-E 처리 후 2시간 반응에서는 LPS와 SP-E를 함께 처리하였 을 경우 85.53%로 감소하는 양상을 나타냈다. 반면, 4시간 반응에서는 30.21%로 유전자 발현이 유의미하게 감소하였다. IL-6의 발현은 염증 유도 후 상당히 증가하였으며, SP-E 처리 후 2시간 반응 시보다는 4시 간 반응 시 유전자의 발현 양상이 더 뚜렷하게 나타나는 것으로 보아 이 는 SP-E가 IL-6 발현을 억제하여 시간이 지남에 따라 더 큰 효과를 나 타낼 수 있음을 시사한다. TNF-α 역시 2시간 반응에서는 발현 변화가 미미하였으나, 4시간 반응에서는 SP-E 처리군에서 유의미한 발현 감 소가 관찰되었다.

    5. Inhibitory effect of SP-E on protein expression of pro-inflammatory cytokines

    사이토카인 mRNA 발현 감소가 실제로 단백질 수준에서의 분비량 감 소로 이어지는지를 확인하기 위해, 사람의 HGF인 hTERT-hNOF 세포 에서도 사이토카인 분비 변화를 관찰하기 위해 구강 병원균 Pg-LPS를 사용하여 확인하였다(Fig. 6). hTERT-hNOF 세포에서 IL-1β의 분비 량은 LPS의 처리 후 검출되지 않아 분비 변화 평가에 제한이 있었다. 그 러나, 다른 사이토카인인 TNF-α의 분비량은 LPS와 함께 CD14, LBP 를 처리한 경우 312.83 pg/mL로 측정되었으며, SP-E를 100 μg/ mL 농도로 추가 처리했을 때 TNF-α는 178.22 pg/mL로 감소하였다. IL-6의 경우 LPS 처리 시 453.97 pg/mL에서 SP-E 처리 후 170.83 pg/mL로 감소했으며, IL-8 역시 480.14 pg/mL에서 276.86 pg/ mL로 감소하였다.

    Discussion

    본 연구는 Pg-LPS로 염증을 유발시킨 hTERT-hNOF에 대한 SP-E 의 항염증 효과를 검증하여 치주질환의 예방과 치료제로서의 활용 가능 성을 알아보기 위해 시행되었다.

    치주 조직에서 가장 풍부한 세포 유형인 인간 치은 섬유모세포는 치 주염의 병인에서 중요한 역할을 한다. HGF는 세포외기질(extracellular matrix) 성분을 생성하고 분해 효소를 분비하며, 감염에 반응하여 면역 조절 인자와 단백질 분해 효소를 방출한다[9,14,22]. HGF는 구강 내 그람 음성 세균의 LPS를 TLR4를 통해 인지하고 활성화되며, 이로 인해 IL-6, IL-8 등 염증성 사이토카인의 분비가 유도되어 염증 반응이 촉진 된다[23-25]. 병원균에 의한 치주 감염은 염증성 사이토카인인 IL-6, TNF-α, IL-1β의 방출을 통해 신경 염증 및 인지 기능 저하를 유발할 수 있으며, 세포 침윤을 통해 염증 반응을 더욱 증폭시킨다[26].

    SP-E의 항염능을 알아보기 위해 Pg-LPS로 염증이 유도된 hTERThNOF 세포에서 염증성 사이토카인인 IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α의 전사 및 번역 수준의 변화를 분석하였다. PCR 분석 결과, Pg-LPS 처 리로 유도된 IL-1β 및 IL-8 발현은 SP-E 처리 후 2시간에서 각각 약 34.00%와 5.57%로 감소하였으며, 4시간 반응 시에는 IL-1β와 IL-8 발현이 각각 약 10.11%와 3.90%로 감소하여 시간 의존적으로 억 제 효과가 나타났다. 이러한 결과는 SP-E가 염증 반응이 주요 매개체 인 IL-1β와 IL-8의 발현을 효과적으로 조절할 수 있음을 시사한다. 반 면, IL-6 발현은 4시간 반응에서 약 30.21%로 유의미하게 감소하였 다(Fig. 5). IL-1β, IL-8, TNF-α는 용량 및 시간 의존적으로 IL-6 발 현을 시너지적으로 증폭시키며, 이는 LPS 단독 처리보다 훨씬 강한 염 증 반응을 일으킬 수 있다[13,26,27]. TNF-α의 경우에는 SP-E 단독 처리 시에는 변화를 보이지 않았으나, Pg-LPS와 SP-E를 함께 처리 한 경우 4시간에서 발현이 감소하였는데, 이는 TNFR1 및 TNFR2 수 용체를 통한 세포 생존과 사멸 신호의 복잡한 조절 기전에 기인하는 것 으로 생각되며[28,29], 이에 대한 추가적인 기전 연구가 필요할 것으로 사료된다. 이와 같은 결과는 치주질환 관련 염증 반응에서 SP-E가 주 요 사이토카인의 발현을 조절하는 메커니즘을 규명하는 데 있어 중요한 단서를 제공하며, 특히 염증 반응의 시간 경과에 따른 SP-E의 조절 효 과가 사이토카인마다 차별적으로 나타날 수 있음을 시사한다. 이러한 유전자 발현의 변화는 24시간 처리 후 단백질 수준에서도 확인되었는 데, ELISA 분석 결과 Pg-LPS 투여로 증가한 TNF-α는 약 43.03%, IL-6는 약 62.37%, IL-8은 약 42.37%가 SP-E 처리에 의해 유의하 게 감소하였다(Fig. 6). 치주염 환자에서 IL-6와 IL-8은 염증 반응 시 함께 증가하는 것으로 보고되었으며[12], HGF에서도 LPS 처리에 의 해 IL-6와 IL-8의 발현이 증가하는 양상이 관찰되었다. 그러나 항염증 물질을 처리할 경우, 사이토카인 발현이 감소하는 유사한 패턴이 나타 났다[24,30]. 다만 IL-1β는 hTERT-hNOF 세포주에서 검출이 제한적 이었는데, 이는 이 세포주에서 IL-1β의 발현이 매우 낮다는 기존 연구 결과와 일치한다[31,32]. 이러한 결과들을 종합하면, SP-E가 염증 유 도 환경에서 TNF-α, IL-6, IL-8의 분비를 효과적으로 억제함을 보여 주며, hTERT-hNOF 세포에서 Pg-LPS에 의해 유도된 사이토카인 분 비가 SP-E 처리에 의해 유의미하게 감소함을 나타낸다. 이러한 결과는 SP-E의 염증 조절 메커니즘이 구강 염증 상태에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다.

    SP-E의 항산화 활성을 DPPH assay를 통해 평가한 결과, SP-E 는 농도 의존적인 라디칼 소거능을 보였다. SP-E 100 μg/mL의 라 디칼 소거능(49.22%)은 L-ascorbic acid 약 25 μg/mL의 소거능 (39.91%)과 유사한 수준을 나타내었다(Fig. 3). 치주균의 LPS는 HGF의 미토콘드리아 내에서 ROS 생성을 증가시키며, 이는 염증성 사이토카인의 분비를 촉진하는 것으로 알려져 있다[33,34]. 본 연구 의 결과 SP-E는 라디칼 소거능을 가진다는 선행 연구들과 일치하며 [4,16,18,19], SP-E가 효과적인 라디칼 소거 활성을 가질 수 있음을 시사한다.

    항산화 효소인 SOD의 활성을 hTERT-hNOF 세포에서 평가한 결과, Pg-LPS 처리로 4.88%까지 감소했던 SOD 활성이 SP-E 처리에 의 해 농도 의존적으로 회복되어 100 μg/mL 농도에서 45.78%까지 증가 하였다(Fig. 4). 특히 SP-E 단독 처리군에서는 무처리군(27.08%)보다 높은 48.54%의 활성을 보여, SP-E가 기저 수준의 SOD 활성도 증진 시킬 수 있음을 확인하였다. 이는 SP-E가 SOD 유사활성을 증가시킨 다는 선행 연구들의 결과와 일치하며[16,18-20], SP-E가 SOD 활성 증진을 통해 항산화 효과를 나타낼 수 있음을 보여준다.

    이상의 결과를 종합해보면 SP-E는 Pg-LPS로 염증이 유도된 hTERT-hNOF에서 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8 등 주요 염증성 사이 토카인의 발현과 분비를 전사 및 번역 수준에서 효과적으로 억제하였 다. 또한 DPPH 라디칼 소거능과 hTERT-hNOF 세포에서의 SOD 활 성 증진을 통해 항산화 효과도 나타내었다. 특히 100 μg/mL 농도에 서 관찰된 SP-E의 우수한 항염증 및 항산화 활성은 치주질환 원인균인 Pg-LPS로 유도된 염증 반응을 효과적으로 억제할 수 있음을 보여주 어, 치주질환 예방 및 치료제로서의 활용 가능성을 시사한다.

    Funding

    이 성과의 일부분은 정부(중소벤처기업부)의 재원으로 한국연구재단 의 지원을 받아 수행된 연구임(No. RS-2023-00224207).

    Conflicts of Interest

    No potential conflict of interest relevant to this article was reported.

    Figure

    IJOB-50-2-64_F1.gif

    Schematic diagram for preparation of ethanol extract from the Salvia plebeia R. Br.

    IJOB-50-2-64_F2.gif

    Cell viability was tested by treating hTERT-hNOF cells with the ethanol extract of Salvia plebeia R. Br. (SP-E). The extracts were used in different concentrations of SP-E (25, 50, 100, and 200 μg/mL) and with or without of lipopolysaccharide (LPS). The results were reported as the mean ± standard definition (n = 6). Statistical significance was evaluated using one-way ANOVA compared to the untreated control group.

    *p < 0.05.

    IJOB-50-2-64_F3.gif

    Radical scavenging activity of the extract measured by DPPH assay. The extract was tested at concentrations ranging from 25, 50, and 100 μg/mL. The results are reported as the mean ± standard definition (n = 4). Statistical significance was evaluated using one-way ANOVA compared to the untreated control group.

    SP-E, Salvia plebeia R. Br. ethanol extract; L-A, L-ascorbic acid; DPPH, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl.

    *p < 0.001.

    IJOB-50-2-64_F4.gif

    Effect of SP-E on LPS-induced SOD activity. hTERT-hNOF cells were pretreated with LPS, CD14, and LBP for 1 hour, followed by treatment with SP-E for 24 hours. The results are reported as the mean ± standard definition (n = 6). Statistical significance was evaluated using oneway ANOVA compared to the LPS-only treatment group.

    SP-E, Salvia plebeia R. Br. ethanol extract; LPS, lipopolysaccharide; SOD, superoxide dismutase.

    *p < 0.001.

    IJOB-50-2-64_F5.gif

    Effect of the ethanol extract of Salvia plebeia R. Br. (SP-E) on lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine expression in hTERT-hNOF cells. hTERThNOF cells were treated with 500 ng/mL LPS in the presence of SP-E for either 2 hours or 4 hours. (A) mRNA expression levels of pro-inflammatory cytokines were analyzed by polymerase chain reaction (PCR). (B) Band density of the PCR products was measured and compared for quantitative analysis. The results were expressed as the mean ± standard definition (n = 3) for density measured in the PCR assay. Statistical significance was evaluated using oneway ANOVA, comparing the results to the LPS-only treatment group.

    IL, interleukin; TNF-α, tumor necrosis factor-α.

    *p < 0.001, **p < 0.05.

    IJOB-50-2-64_F6.gif

    Measurement of inflammatory cytokine secretion in the culture medium of hTERT-hNOF cells. (A) IL-1β, (B) TNF-α, (C) IL-6, and (D) IL-8 levels were measured using an ELISA kit. The results are reported as the mean ± standard definition (n = 6). Statistical significance was evaluated using one-way ANOVA compared to the LPS-only treatment group.

    SP-E, Salvia plebeia R. Br. ethanol extract; LPS, lipopolysaccharide; IL, interleukin; TNF-α, tumor necrosis factor-α; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay.

    *p < 0.001.

    Table

    The polymerase chain reaction primer sequences used in this study for amplification of each gene from hTERT-hNOF cells

    TNF-α, tumor necrosis factor-α; IL, interleukin.

    Reference

    1. Jeong HR, Sung MS, Kim YH, Ham HM, Choi YM, Lee JS. Anti-inflammatory activity of Salvia plebeia R. Br. leaf through heme oxygenase-1 induction in LPS-stimulated RAW264.7 macrophages. J Korean Soc Food Sci Nutr 2012;41:888-94.
    2. Kim M, Kim JY, Yang HS, Choe JS, Hwang IG. Nepetoidin B from Salvia plebeia R. Br. inhibits inflammation by modulating the NF-κB and Nrf2/HO-1 signaling pathways in macrophage cells. Antioxidants (Basel) 2021;10:1208.
    3. Lee HW, Kang YR, Bae MS, Kim YH. Anti-inflammatory effects of 1,2,3,4,6-Penta-O-galloyl-β-D-glucose in LPSstimulated macrophages. J Korean Soc Food Sci Nutr 2017; 46:409-16.
    4. Shin J, Park J, Jun W. Effect of hot water extract of Salvia plebeia R. on the production of splenocyte cytokines in mouse. J Korean Soc Food Sci Nutr 2020;49:754-8.
    5. Han Y, Yuan C, Zhou X, Han Y, He Y, Ouyang J, Zhou W, Wang Z, Wang H, Li G. Anti-inflammatory activity of three triterpene from Hippophae rhamnoides L. in lipopolysaccharidestimulated RAW264.7 cells. Int J Mol Sci 2021;22:12009.
    6. Li R, Kato H, Taguchi Y, Deng X, Minagawa E, Nakata T, Umeda M. Glucose starvation-caused oxidative stress induces inflammation and autophagy in human gingival fibroblasts. Antioxidants (Basel) 2022;11:1907.
    7. Insuan O, Janchai P, Thongchuai B, Chaiwongsa R, Khamchun S, Saoin S, Insuan W, Pothacharoen P, Apiwatanapiwat W, Boondaeng A, Vaithanomsat P. Anti-inflammatory effect of pineapple rhizome bromelain through downregulation of the NF-κB- and MAPKs-signaling pathways in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW264.7 cells. Curr Issues Mol Biol 2021;43:93-106.
    8. Shin JH, Kim SS, Seo SR. Anti-inflammatory effects of Stephania brachyandra extract in LPS-triggered inflammatory signaling. Korean J Microbiol 2022;58:120-6.
    9. Zhang H, Huang J, Fan X, Miao R, Wang Y. HSP90AA1 promotes the inflammation in human gingival fibroblasts induced by Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide via regulating of autophagy. BMC Oral Health 2022;22:366.
    10. Jurdziński KT, Potempa J, Grabiec AM. Epigenetic regulation of inflammation in periodontitis: cellular mechanisms and therapeutic potential. Clin Epigenetics 2020;12:186.
    11. Lee YY, Kang SA. Antioxidative and anti-inflammatory activities of Salvia plebeia R. Br extracts. Korean J Food Nutr 2020;33:483-92.
    12. Noh MK, Jung M, Kim SH, Lee SR, Park KH, Kim DH, Kim HH, Park YG. Assessment of IL-6, IL-8 and TNF-α levels in the gingival tissue of patients with periodontitis. Exp Ther Med 2013;6:847-51.
    13. Xiong G, Ji W, Wang F, Zhang F, Xue P, Cheng M, Sun Y, Wang X, Zhang T. Quercetin inhibits inflammatory response induced by LPS from Porphyromonas gingivalis in human gingival fibroblasts via suppressing NF-κB signaling pathway. Biomed Res Int 2019;2019:6282635.
    14. Blancas-Luciano BE, Becker-Fauser I, Zamora-Chimal J, Delgado-Domínguez J, Ruíz-Remigio A, Leyva-Huerta ER, Portilla-Robertson J, Fernández-Presas AM. Antimicrobial and anti-inflammatory activity of Cystatin C on human gingival fibroblast incubated with Porphyromonas gingivalis. PeerJ 2022;10:e14232.
    15. Lee YK, Kim CH, Jeong DW, Lee KW, Oh YT, Kim JI, Jeong JW. Anti-inflammatory and antioxidative effects of lotus root extract in LPS-PG-stimulated human gingival fibroblast-1 cells. Korean J Plant Resour 2022;35:565-73.
    16. Kim YJ, Jeong JS, Park NJ, Go GB, Son BG. Active ingredients and antioxidant activities of Salvia plebeia R. Br. According to pretreatment conditions. J Korean Soc Food Sci Nutr 2014;43:1948-53.
    17. Kim SO, Kim MR, Hwang KA, Park NJ, Jeong JS. Inhibition of differentiation and anti-adipogenetic effect of the Salvia plebeian R. Br. ethanol extract in murine adipocytes, 3T3-L1 cells. J Korean Soc Food Sci Nutr 2017;46:401-8.
    18. Liang YY, Wan XH, Niu FJ, Xie SM, Guo H, Yang YY, Guo LY, Zhou CZ. Salvia plebeia R. Br.: an overview about its traditional uses, chemical constituents, pharmacology and modern applications. Biomed Pharmacother 2020;121:109589.
    19. Lim JA, Yun BW, Baek SH. Antioxidative activity and nitrite scavenging ability of methanol extract from Salvia plebeia R. Br.. Korean J Med Crop Sci 2007;15:183-8.
    20. Choi BK, Lee SH, Kim NS, Cho SY, Jang HH, Kim JB, Lee YM, Yoon S, Lee SH. Anti-oxidative and anti-allergic effects of Salvia plebeia R. ethanol extracts. Korean J Pharmacogn 2014;45:332-7.
    21. Jang HH, Cho SY, Kim MJ, Kim JB, Lee SH, Lee MY, Lee YM. Anti-inflammatory effects of Salvia plebeia R. Br extract in vitro and in ovalbumin-induced mouse model. Biol Res 2016;49:41.
    22. Alshibani N, AlKattan R, Allam E, Alshehri FA, Shalabi MM, Almuhanna N, Almarshad H, Aljamili A. Effects of metformin on human gingival fibroblasts: an in vitro study. BMC Oral Health 2023;23:292.
    23. Huang C, Zhang C, Yang P, Chao R, Yue Z, Li C, Guo J, Li M. Eldecalcitol inhibits LPS-induced NLRP3 inflammasomedependent pyroptosis in human gingival fibroblasts by activating the Nrf2/HO-1 signaling pathway. Drug Des Devel Ther 2020;14:4901-13.
    24. Jung JI, Kim S, Baek SM, Choi SI, Kim GH, Imm JY. Ecklonia cava extract exerts anti-inflammatory effect in human gingival fibroblasts and chronic periodontitis animal model by suppression of pro-inflammatory cytokines and chemokines. Foods 2021;10:1656.
    25. Neurath N, Kesting M. Cytokines in gingivitis and periodontitis: from pathogenesis to therapeutic targets. Front Immunol 2024;15:1435054.
    26. Harorli OT, Hatipoglu M, Erin N. Effect of photobiomodulation on secretion of IL-6 and IL-8 by human gingival fibroblasts in vitro. Photobiomodul Photomed Laser Surg 2019;37:457-64.
    27. Wielento A, Lagosz-Cwik KB, Potempa J, Grabiec AM. The role of gingival fibroblasts in the pathogenesis of periodontitis. J Dent Res 2023;102:489-96.
    28. Kempe S, Kestler H, Lasar A, Wirth T. NF-kappaB controls the global pro-inflammatory response in endothelial cells: evidence for the regulation of a pro-atherogenic program. Nucleic Acids Res 2005;33:5308-19.
    29. Webster JD, Vucic D. The balance of TNF mediated pathways regulates inflammatory cell death signaling in healthy and diseased tissues. Front Cell Dev Biol 2020;8:365.
    30. Wang QB, Sun LY, Gong ZD, Du Y. Veratric acid inhibits LPSinduced IL-6 and IL-8 production in human gingival fibroblasts. Inflammation 2016;39:237-42.
    31. Kwon JS, Piao YZ, Cho SA, Yang SY, Kim JH, An S, Kim KM. Biocompatibility evaluation of dental luting cements using cytokine released from human oral fibroblasts and keratinocytes. Materials (Basel) 2015;8:7269-77.
    32. Moharamzadeh K, Van Noort R, Brook IM, Scutt AM. Cytotoxicity of resin monomers on human gingival fibroblasts and HaCaT keratinocytes. Dent Mater 2007;23:40-4.
    33. Bullon P, Cordero MD, Quiles JL, Ramirez-Tortosa Mdel C, Gonzalez-Alonso A, Alfonsi S, García-Marín R, de Miguel M, Battino M. Autophagy in periodontitis patients and gingival fibroblasts: unraveling the link between chronic diseases and inflammation. BMC Med 2012;10:122.
    34. Liu J, Zeng J, Wang X, Zheng M, Luan Q. P53 mediates lipopolysaccharide-induced inflammation in human gingival fibroblasts. J Periodontol 2018;89:1142-51.
    Copyright © Korean of Oral Biology and the UCLA Dental Research Institute. All rights reserved.