Introduction

에나멜로이드(enameloid)는 양서류 중 유미류(caudate)와 어류의 치아에서 법랑질(enamel)과 상아질(dentine) 사이에 형성되는 조직이고, 치아뿐만 아니라 어류의 외피에 있는 비늘(scale)과 치아돌기(denticle)의 바깥층에서 형성되는 것으로 보고되었다[1-11]. 에나멜로이드는 법랑질과 유사하게 매우 강하게 광화된 조직이기 때문에, 치아와 비늘, 치아돌기는 고생대에 생존했던 동물의 화석에서 잘 보존되어 있다[9-12]. 에나멜로이드는 포유류와 파충류의 화석에서 발견되지 않아 조상조직(plesiomorphy)으로 알려져 있고, 오랜 기간 동안 환경의 변화에 따라 동물이 진화되는 과정을 반영하는 조직으로 알려져 있다[9,10].

법랑질과 상아질의 사이에 형성되는 에나멜로이드는 아교섬유를 주요 성분으로 이루어져 있어 상아질과 유사한 특징을 나타내고[1-9], 어류와 양서류의 에나멜로이드에서 확인된 amelogenin의 발현으로 법랑질모세포와 상아질모세포로부터 유래되는 이중기원(dual origin)으로 보고되었다[13]. 어류와 양서류, 파충류의 치아는 주기적으로 반복되는 발생과정을 거치게 되는 다생치(polyphyodont)이고, 어류의 에나멜로이드는 치아에서 잘 보존되어 있는 반면에 유미류의 에나멜로이드는 치아에서 유생시기에만 나타나고, 변태 후에는 사라지는 것으로 보고되었다[7,8,14]. 에나멜로이드와 법랑질은 서로 밀접한 조직이고 유미류에서는 에나멜로이드가 법랑질이나 상아질 중 어떤 조직으로 이행되는지 뚜렷하지 않고, 치아의 진화와 기원을 이해하기 위해 계통발생학적 연구와 형태학적, 분자생물학적 연구를 통해 양서류의 유미류와 어류를 실험동물 모델로 활용하고 있다[1-14].

치아는 형태학적으로 판시기(lamina stage)와 모자시기(cap stage)에 치아상피와 치아유두에서 발현되는 유전인자의 상호작용으로 발생하고, 종시기(bell stage)에 이르러 무기질의 침착되는 것으로 보고되었다[15]. 에나멜로이드가 광화되는 과정에서는 아교섬유의 침착이 선행되고, 기질소포(matrix vesicle)에 포함된 기질단백질과 아교섬유의 작용으로 무기질이 침착되는 과정을 거치게 된다[1-9]. 어류의 치아와 비늘에서 형성되는 법랑질/에나멜로이드에서 scpp5와 ameloblastin, enamelin의 발현과 육기어류(sarcopterygian)에 포함되는 포유류와 파충류, 양서류의 법랑질에서 amelogenin과 ameloblastin, enamelin의 발현을 토대로 치아와 비늘은 공진화(coevolution)되는 것으로 보고되었다[11]. 생쥐와 아프리카발톱개구리, 어류(Latimeria chalumnnae)에서 조상유전자로 알려진 sparc의 발현과 유미류 치아의 법랑질모세포에서 amelogenin과 col1a1의 발현을 근거로 법랑질과 에나멜로이드는 상동 조직이라고 보고하였다[8,12,16].

계통분류체계와 형태학적, 분자발생학적으로 양서류의 치아는 어류의 치아에 비해 포유류의 치아와 유사하고, 동물의 진화를 이해하기 위해 광화시기와 성숙시기에 연구되고 있지만, 치아 발생과정 초기 광화되기 이전의 모자시기에 에나멜로이드의 미세구조는 잘 알려져 있지 않다. 이에 본 실험실에서는 양서류에 해당하는 아프리카발톱개구리 치아의 초기 발생과정 중 형성되는 치배에서 에나멜로이드의 미세구조를 확인하고자 한다.

Materials and Methods

1. Experimental animals and stereomicroscopic observation

본 실험은 다음과 같은 실험방법으로 전북대학교 동물실험윤리위원회의 승인(승인번호 NON2022-094)하에 시행되었다. 본 실험실에서 사육하고 있는 성숙한 아프리카발톱개구리 암컷에서 배란을 유도하기 위하여 등쪽림프주머니(dorsal lymph sac)에 human chorionic gonadotropin (대성미생물연구소) 1,000 IU를 주사하였다. 다음날 알을 수집하였고, 수컷의 고환을 채취하여 0.1X normal amphibian medium (NAM) 용액에 넣어 잘게 자른 다음, 상층액을 알에 뿌려 수정시켜 0.1X NAM 용액에서 배양하였다. 아프리카발톱개구리 올챙이의 위턱에서 치배는 stage 55부터 발생되었다고 보고되었다[17]. 올챙이에서 치배가 발생되는 시기부터 치아기질이 형성되는 시기까지, 치배의 발달과정을 확인하기 위해 Nieuwkoop과 Faber [17]의 기준에 따라 stage 55와 56, 57 올챙이를 각 시기별로 5마리씩 수집하였고, 위턱을 해부하여 실체현미경(MZ16; Leica)으로 관찰한 다음 사진촬영하였다. 각 시기에 따라 치배의 형태가 유사하게 관찰되는 것을 확인하기 위해 동일한 방법으로 3회 반복하였다.

2. Tissue preparation

실체현미경으로 관찰하여 stage 57 아프리카발톱개구리 올챙이의 위턱에서 모자시기(cap stage)와 종시기(bell stage)의 치배가 번갈아 위치하여 발생하는 것을 확인하였고, 이 시기에 해당하는 올챙이의 위턱을 1X phosphate-buffered saline (PBS)으로 희석한 4% 파라포름알데하이드 용액(pH 7.4)으로 4℃에서 14–16시간 동안 고정하였고, 채취된 조직은 10% sucrose/1X PBS 용액(pH 7.4)으로 4℃에서 1일 동안 세척하였다. 조직절편을 제작하기 위해 일련의 탈수과정과 침투과정을 거쳐 치아의 시상단면을 관찰하기 위해 파라핀으로 포매하였고, 치배의 형태와 치아기질에서 아교섬유와 광화과정을 관찰하기 위해 5 μm 절편을 제작하였다.

3. Hematoxyline-eosin, picrosirius red, and von Kossa staining

치배의 형태와 치아기질 내에 형성되는 무기질과 아교섬유를 구분하기 위해 다음과 같이 3가지 염색방법을 시행하였다. 각각의 염색방법은 5회 실시하였고, 각 슬라이드에 40개의 절편을 수집하였다. Hematoxylin-eosin (H-E)과 picrosirius red (PR) 염색을 5회 반복 시 동일한 염색 결과가 확인되었다. Von Kossa (VK) 염색에서는 silver nitrate 염색에 대하여 각각 30분과 10분을 실시한 결과 동일한 염색 결과가 관찰되었다. 또한, VK 염색에서 일반적인 대조염색으로 safranin O를 사용하나, 본 실험에서는 0.01% toluidine blue 용액을 사용하였다. 0.1% toluidine blue 용액은 silver nitrate 용액으로 염색된 치아기질에 겹치는 현상이 나타났지만 낮은 농도의 toluidine blue 용액(0.01%)은 치아기질에 중복되지 않아 대조염색으로 적합한 것이 확인되었다.

① H-E 염색: 조직학적 관찰을 위해 mayer’s hematoxylin과 0.2% alcoholic eosin으로 각각 1분 동안 염색하였다.

② PR 염색: 아교섬유의 분포를 확인하기 위해 weigert’s hemaxotylin과 PR로 각각 5분, 1시간 동안 염색하였다.

③ VK 염색: 광화시기를 확인하기 위해 5% silver nitrate와 0.01% toluidine blue로 각각 10분, 5분 동안 염색하였다. 이상의 조직염색을 시행한 이후 탈수과정과 투명과정을 거친 후 canada balsam으로 봉입하였다.

4. Preparation for transmission electron microscopy

아프리카발톱개구리의 치배 초기 발생과정에서 에나멜로이드의 형성과정을 분석하기 위해 치배의 모양을 모자시기와 이른 종시기(early bell stage), 늦은 종시기(late bell stage)로 구분하였다. 모자시기와 이른 종시기의 치배는 stage 56에서, 모자시기와 늦은 종시기의 치배는 stage 57에서 관찰되는 것을 실체현미경으로 확인하였다. 각 치배에서 형성되는 에나멜로이드의 미세구조를 관찰하기 위해 조직을 채취하여 1.5% glutaraldehyde/1.5% paraformaldehyde/0.1 M cacodylate 용액(pH 7.4)으로 4℃에서 2시간 동안 전고정하였고, 1% osmium tetroxide/0.1 M cacodylate 용액(pH 7.4)으로 4℃에서 2시간 동안 후고정하였다. 알코올로 일련의 탈수과정과 Epon 812 (Electron Microscopy Sciences) 수지를 이용하여 중합과정을 시행하였다. 각 시기별 3회의 반복 실험을 시행하였고, 광학현미경을 이용하여 파라핀으로 포매하여 제작된 절편과 전자현미경 표본의 1 μm 후박절편을 비교하여 유사한 형태의 치배를 확인하였다. 이어서 90 nm 초박절편을 제작하였고, 각 표본당 12개의 절편을 수집하여 uranyl acetate와 lead citrate 용액으로 염색한 후 투과전자현미경(H-7650; Hitachi)으로 사진촬영하였다.

Results

1. Stereomicroscopic and histological observations

1) Stereomicroscopic findings

치배는 입술 쪽에 가깝게 배열되어 있었고, 치배의 배열은 입술 가장자리를 따라서 활모양으로 휘어져 있었다(Fig. 1A-1C, 1A′-1C′). 각 시기별 아프리카발톱개구리 올챙이의 위턱에서는 모자시기의 치배가 관찰되었고, stage 56과 57에서는 모자시기를 포함하여 이른 종시기와 늦은 종시기의 치배가 각각 확인되었다(Fig. 1A-1C, 1A′-1C′). Stage 56과 57에서 관찰되는 모자시기와 종시기의 치배가 치아활(dental arch)에서 번갈아 놓이는 순서로 확인되었다(Fig. 1B, 1C, 1B′, and 1C′).

2) Histological findings

① 모자시기: 치아상피는 구강상피와 연속되어 연결되어 있었고 치배의 세로축은 구강상피층과 수직방향이었다(Fig. 1D-1F). 치아상피는 치배의 입술 쪽과 혀 쪽에서 중간엽 쪽으로 돌출되어 있고, 밀집된 치아유두세포들을 에워싸는 모양이다(Fig. 1D-1F). 치아상피는 원주형의 안쪽 치아상피와 입방형의 바깥 치아상피로 구분되었고, 치아상피 사이에는 한 층의 세포들로 이루어진 별모양그물세포들이 관찰되었다(Fig. 1D-1F). 치아상피와 치아유두 사이에는 빈 공간으로 보이는 무형질이 관찰되었다(Fig. 1D-1F).

② 종시기: 입술 쪽의 치아상피는 중간엽-치근단 쪽으로 발달하여 치아의 세로축은 구강상피층과 나란한 방향이었다(Fig. 1G-1I). 치배는 법랑질모세포층와 치아바깥상피층, 별모양그물조직층으로 이루어져 있고, 법랑질모세포는 모자시기 치배의 안쪽 치아상피에 비해 길어져 이 세포들의 핵은 법랑질에서 멀어져 있었다(Fig. 1G-1I). 바깥 치아상피는 입방형에서 편평형으로 바뀌었다(Fig. 1G-1I). 치수에는 약 30개 정도의 세포들이 밀집되어 있었고, 대부분의 치아유두세포들은 치밀한 핵을 가지고 있어 아직 미분화된 상태로 관찰되었으며, 치관 쪽에서 하나의 세포가 원주형의 상아질모세포로 관찰되었다(Fig. 1G-1I).

이 시기에는 법랑질과 에나멜로이드, 상아질이 형성되어 있었고, H-E 염색(Fig. 1G)에서 법랑질은 분홍색으로, 에나멜로이드와 상아질은 갈색으로 관찰되었다. VK 염색(Fig. 1H)에서 법랑질과 에나멜로이드, 상아질은 검은색이었고, 전상아질(predentin)은 염색되지 않아 빈 공간처럼 관찰되었다. PR 염색(Fig. 1I)에서 법랑질은 진한 갈색으로, 에나멜로이드와 상아질, 전상아질은 빨간색으로 나타났다.

2. Ultrastructural findings

① 모자시기(Fig. 2A-2C): 안쪽 치아상피와 치아유두 사이에 빈 공간으로 보이는 무형질(Fig. 2A)에는 10–30 nm 두께의 아교섬유들이 확인되었고, 안쪽 치아상피에서 뻗어 나온 아교섬유들은 치아유두에 연결된 아교섬유들보다 가늘었으며, 치아유두세포에 연결된 아교섬유에서는 가로무늬가 관찰되었다(Fig. 2C). 안쪽 치아상피의 세포질에는 무수히 많은 당원과립들로 채워져 있었고, 안쪽 치아상피의 무형질 쪽 세포막과 인접한 기저막은 흐려져 있었다(Fig. 2C and 2D). 기저막에 인접한 안쪽 치아상피의 세포막에는 오목하게 패인 소와(pit)와 원형소포(samll vesicle), 공포들이 관찰되었다(Fig. 2B-2D). 소와 내에는 솜털 같은 물질들이 채워져 있었다(Fig. 2D).

② 초기 종시기(Fig. 2E-2H): 법랑질모세포와 상아질모세포 사이 기질은 옅게 염색되었고(Fig. 2E), 이 기질 내에서 아교섬유들은 일정한 방향성이 없이 무질서하게 배열되어 있었고, 아교섬유의 두께는 40–50 nm였다. 일부 아교섬유에서는 가로무늬가 관찰되었다(Fig. 2G and 2H). 법랑질모세포의 기저막은 관찰되지 않았고 대부분의 아교섬유들은 법랑질모세포에서 박혀 있었다(Fig. 2G and 2H). 아교섬유와 가깝게 치밀한 결정체들이 침착되었다(Fig. 2G and 2H). 법랑질모세포의 세포질 내에는 당원과립들로 채워져 있었고, 원형의 분비과립이 관찰되었다(Fig. 2G and 2H).

③ 후기 종시기(Fig. 2I-2L): 법랑질모세포와 상아질모세포 사이에는 치아기질이 형성되어 있고, 치아기질은 법랑질과 에나멜로이드, 상아질, 전상아질이 구분되었다(Fig. 2I). 법랑질모세포와 인접하고 법랑질은 진하고 얇게 염색되었고, 에나멜로이드와 상아질은 법랑질보다 밝게 염색되었다. 에나멜로이드와 상아질은 명확하게 구분되지 않았다. 전상아질은 거의 염색되지 않아 빈 공간처럼 보였다(Fig. 2I). 법랑질모세포의 핵은 법랑질로부터 멀어져 있었고 법랑질에 근접한 법랑질모세포의 세포질에서는 다양하게 관찰되는 치밀도의 분비과립들이 관찰되었다(Fig. 2K). 법랑질의 표면에는 중간 정도의 치밀도를 나타내는 분비과립의 내용물과 유사한 물질로 덮여 있었다(Fig. 2K). 법랑질 결정체 리본들은 겹겹이 나란하게 배열되어 있었지만 결정체 다발의 방향은 부채꼴로 배열되어 있었다(Fig. 2L). 법랑질의 안쪽에 형성된 에나멜로이드는 아교섬유들로 구성되어 있었고, 치근쪽의 아교섬유의 배열은 성글게 나타났으며, 치근 쪽의 아교섬유들은 치밀하게 분포되었다(Fig. 2K).

Discussion

본 연구에서 아프리카발톱개구리에서 치배의 초기 발생과정에서 1) 치배의 배열과, 2) 무기질의 침착과 아교섬유의 분포에 관한 조직학적 관찰, 3) 에나멜로이드의 미세구조를 분석하기 위해 실체현미경과 광학현미경, 투과전자현미경을 이용하였다. 그 결과, 실체현미경 관찰에서 stage 57 올챙이에서 모자시기와 종시기의 치배가 서로 번갈아 가는 순서로 형성되었고, 치아기질에 침착된 무기질은 stage 57 올챙이의 종시기 치배에서 VK 염색으로 관찰되었다. 아교섬유와 서로 인접하는 법랑질과 에나멜로이드는 PR 염색으로 명확하게 구분되었다. 안쪽 치아상피(법랑질모세포)와 치아유두세포(상아질모세포) 사이에 형성되는 무형질과 치아기질 내에서 아교섬유는 종시기에서 이들 세포들 사이에 치밀하게 배열되었다. 모자시기의 무형질에 해당하는 부위에서 관찰되는 아교섬유는 성글게 분포되었으며, 안쪽 치아상피와 치아유두세포 각각에 연결된 아교섬유들이 명확하게 구분되었다.

다생치의 동물에서 치배와 치아패턴에 관한 연구에서 송사리의 치배와 치아는 입안에서 관찰되지 않았고, 인두에서 3개의 치아가 형성되는데 치아의 방향은 일정한 방향이 없이 다양하게 배열되었다[5]. 상어의 치아는 각각 다른 발달시기를 나타내는 5개의 치배 또는 치아가 겹쳐서 입술 주위 외피에서 입안으로 배열되었다[18]. 유미류와 아프리카발톱개구리에서는 2–3열로 겹친 치배 또는 치아가 번갈아 배열되었다[19]. 아프리카발톱개구리의 치배 초기 발생에서 치배의 배열은 선행연구에서 보고된 치아의 배열과 동일하게 확인되었다. 본 연구에서 활용한 PR 염색은 법랑질과 에나멜로이드를 구분하는 데 유용하게 이용될 것으로 사료된다.

치아의 법랑질은 기질단백질의 작용에 의해 무기질의 침착이 이루어지고, 광화시기와 성숙시기로 구분되는데, 광화시기 이전에는 amelogenin과 ameloblastin, enamelin이 법랑질모세포에서 합성, 분비되고, 광화시기에는 기질 내 분비된 법랑질단백질의 작용에 의해 무기질의 침착이 이루어지며, 성숙시기에는 법랑질모세포에서 분비되는 MMP20과 KLK4에 의해서 기질단백질을 분해하거나 기질단백질들이 법랑질모세포로 흡수되는 과정을 거치게 된다[15]. 에나멜로이드는 amelogenin의 다클론 항체(polyclonal antibody)를 이용하여 어류와 양서류, 파충류, 포유류의 치아에서 확인되었고, 법랑질과 에나멜로이드는 상동조직이라고 제안되었다[13]. 기질단백질에 대한 단일클론 항체(monoclonal antibody)를 이용하였을 때, ameloblastin과 enamelin의 발현은 포유류와 파충류, 양서류, 어류의 치아에서 보고되었고, amelogenin은 포유류와 파충류, 변태 후 양서류의 치아에서 발현되었으나, 유생시기의 양서류와 어류의 치아에서는 발현되지 않았다[20]. 결합조직에서 발현되는 col1a1은 변태 전 양서류의 법랑질모세포에서 발현되었지만, 변태 후 양서류의 법랑질모세포에서는 발현되지 않았고 amelogenin이 발현되었다[8]. 최근에 어류의 치아에서 amelogenin 대신 scpp5의 발현이 보고되었다[11]. 이와 연구된 자료를 근거로 변태 후 양서류와 어류의 치아와 포유류와 파충류, 변태 전 양서류의 치아는 서로 독립적인 진화과정을 따르고, 변태 전 양서류와 어류의 치아는 조상조직일 것이라고 제안되었다. 또한 어류의 치아와 비늘에서는 amelogenin 대신 scpp5의 발현이 보고되었는데[11], 이는 어류의 치아와 비늘은 상동조직으로 추정되고 있다.

에나멜로이드의 미세구조에 관한 연구는 어류의 치아에서 기질형성시기와 광화시기, 성숙시기로 구분되어 보고되었고[1-6,9-11], 양서류 중에서는 유미류의 치아가 유일하게 보고되었다[7,8]. 에나멜로이드의 기질 내에서 형성된 소포의 미세구조에 따라 다른 용어들이 사용되고 있는데, 경골어류의 에나멜로이드는 원형의 소포들이 분포되어 있었고, 연골어류에서는 막대형 소포(tubular vesicle)로 구성된 에나멜로이드를 아다멜로이드(adameloid)로, 유미류의 에나멜로이드에서는 원형의 소포가 관찰되었는데 이들은 레파멜로이드(lepameloid)로 보고되었다[1-7,14,20]. 최근에는 하등동물의 치아와 비늘, 치아돌기의 바깥층에서 아교섬유로 이루어진 조직을 포괄적인 의미로 에나멜로이드로 통합되었다[21]. 포유류와 파충류의 치아에서 에나멜로이드는 확인되지 않지만, 양서류와 어류의 치아에서 발생하는 에나멜로이드는 법랑질 또는 상아질 중 어느 조직으로 이행되는지 여전히 논란이 되고 있다. 특히, 양서류의 치아에서는 변태 전 유생시기에 에나멜로이드가 형성되지만 변태 후에는 법랑질의 형성된 후 에나멜로이드는 상아질과 구분되지 않았다[14]. 변태 전 유생시기 양서류 치배의 법랑질모세포에서 col1a1의 발현을 통해 치아의 진화와 기원에 중요한 의문점을 제시하였다. 현재까지 에나멜로이드의 미세구조에 관한 연구는 치아기질이 형성되는 시기에 보고되었고 본 연구에서는 기질형성 이전시기 치배에서 아교섬유의 분포를 관찰하였다. 그 결과, 미세한 아교섬유가 모자시기의 안쪽 치아상피에 직접 연결되어 있는 것을 확인하였다. 이는 안쪽 치아상피가 법랑질모세포로 분화되기 이전부터 에나멜로이드의 형성에 관여할 것으로 사료되고, 본 연구를 토대로 아프리카발톱개구리의 치아를 대상으로 법랑질 기질단백질과 아교섬유 단백질의 발현을 비교 분석하여 치아의 진화과정에 대한 근거를 제시할 수 있을 것으로 사료된다.

본 연구결과를 토대로 변태 후 아프리카발톱개구리에서 반복적으로 형성되는 계승치아의 발생과정에서 에나멜로이드에 대한 면역조직학적 연구와 분자유전학적 연구를 수행하고자 한다.