서 론

구취는 구강 또는 비강을 통하여 나오는 불쾌한 냄새 로 정의되며, 원인으로는 호흡기계, 위장관계 및 기타 전 신 질환과 관련된 구취와, 치아우식증, 치주질환, 불량 보 철물 및 정상적인 타액 분비가 안 되는 구강 내 원인들이 다[1]. 구강 내 원인에 의한 구취환자가 많은 부분을 차지 하며, 구강 내 구취 원인을 보면 구강세균에 의한 원인과 생리적인 원인으로 나눌 수 있다[2,3]. 이중에 구취환자의 80%정도가 구강세균에 의한 음식물 부패로부터 휘발성 황화합물 생성이 기인하는 것으로 알려졌다[4]. 휘발성 황 화합물은 주로 혐기성 세균에 의해서 발생되며, 황을 함유하는 cysteine과 methionine같은 아미노산이 포함된 단 백질이 효소에 의해서 분해될 때 생성되는 것으로 보고되 고 있다[5]. Cystein에서 수산화황(H₂S)이 만들어지고, methionine에 의해서 유화메틸(CH₃SH), 디메틸설파이드 ((CH₃)₂S)이 생성된다. Porphyromonas gingivalis는 그람음 성 혐기성 세균이며, benzoyl-DL-arginine-naphthylamide (BANA) 시험 양성 세균으로 많은 종류의 효소를 갖고 있 다[6]. 이 효소 중에 트립신유사 효소(trypsin-like enzyme) 에 의해서 휘발성 황화합물인 수산화황, 유화메틸, 디메 틸설파이드를 생성한다[7,8]. Fusobacterium nucleatum 또 한, cystein과 methionine을 이용하여 휘발성 황화합물을 만드는 것으로 알려져 있다[9,10].

프로바이오틱은 살아있는 미생물로 사람의 건강에 이 로운 영향을 주는 세균으로[11], 이 세균을 이용하여 사람 의 건강 유지와 이 세균의 특징에 대한 연구가 활발히 이 루어지고 있다. 프로바이오틱 중에 lactobacilli는 병원성 세균으로부터 사람을 보호해주며, 선천 면역을 자극하는 것에 의해서 건강을 유지시키는데 중요한 역할을 한다 [12,13]. L. casei 및 L. rhamnosus는 항균제제를 분비하는 것과 면역체계의 자극에 의해서 장관계 건강에 가장 효과 적으로 보고되었다[14,15]. 또한 치아우식에 대해서도 예 방효과가 있는 것으로 알려졌다[16,17].

이 연구의 목적은 구강건강에 도움을 주는 L. casei 및 L. rhamnosus가 치주원인균인 F. nucleatum과 P. gingivalis 의 휘발성 황화합물 생성에 어떠한 영향을 미치는지 조사 하고 메커니즘을 분석하는데 있다.

재료 및 방법

세균 및 세균 배양

본 실험에 사용된 균주로는 구취유발 관련 세균으로 Porphyromonas gingivalis ATCC 33277, 및 Fusobacterium nucleatum ATCC 25586을 사용하였으며 Brain heart infusion (BHI; BD bioscience, San Jose, CA, USA)에 헤 민(hemin; 5 ug/ml) 및 비타민 K (0.2 ug/ml)를 첨가한 배 지를 이용하여 37°C, 혐기상태 (H₂ 5%, CO₂ 10% 및 N₂ 85%)에서 배양하였다. 프로바이오틱스로는 Lactobacillus casei ATCC 334 및 Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103)을 사용하였으며, Man Rogosa and Sharpe (MRS; BD bioscience, San Jose, CA, USA)배지를 이용하여 3 7°C에서 배양하였다.

프로바이오틱스의 항균활성도 측정

L. casei 및 L. rhamnosus를 배양 후, 7,000 x g에서 10 분간 원심분리하여 얻은 상층액을 갖고 항균력 시험을 수행하였다. 항균 감수성 시험은 Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI)의 방법대로 수행하였다[18]. 헤 민과 비타민 K를 첨가한 BHI (180 μl)를 96-well 폴리 스티렌 배양접시(SPL Lifescience, Gyeonggi)의 각 well에 분주하고 두 프로바이오틱스 세균 배양액 (180 μl)을 첫 번째 well에 넣고 다채널피펫을 이용하여 두 배씩 연 속희석을 한다. 37°C 혐기상태에서 36시간 배양 후 흡광 광도계를 이용하여 600nm에서 흡광도를 측정하였다.

휘발성 황 화합물 측정

F. nucleatum 및 P. gingivalis를 프로바이오틱스와 혼합 또는 단독 배양 후, 세균 배양액 1 ml를 깨끗한 50 ml 원추 튜브에 옮겼다. 또한 휘발성 황 화합물 억제 메커니즘을 조 사하기 위해서, 프로바이오틱 세균을 배양액을 7,000 x g에 서 10분간 원심분리하고 상층액을 분리하고 이를 0.22 um 폴리비닐릴플로라이드 필터(PVDF; Millipore co., Belleica, MA, USA)로 여과멸균을 수행하고, 프로바이오틱 침전물 은 인산완충용액으로 세척후 4°C에 보관하였다. 여과멸균 한 프로바이오틱 배양액 및 프로바이오틱 세균을 F. nucleatum 및 P. gingivalis의 배양액과 혼합하고 깨끗한 50 ml 원추튜브에 옮긴다. 5분간 실온에서 방치 후, 용액표면 바로 위에 있는 공기를 10 ml 주사기를 이용하여 얻었다. 1 ml 눈금까지 주사기를 누르고 다시 10 ml 눈금까지 당겨 서 공기를 희석한다. 그 후 가스 크로마토그래프(Oral chroma™; FIS Inc., Itami, Hyogo, Japan)을 이용하여 황화수 소(H₂S), 유화메틸(CH₃SH) 및 디메틸설파이드((CH₃)₂S)를 측정하였다.

통계학적 유의성 검사

대조군과 실험군의 통계학적 유의성 검사는 SPSS 10 (SPSS Inc., Chicago, IL)을 사용하고 Mann-whitney 및 U-test를 이용하여 분석하였다. P 수치는 0.05 미만일 때 통계학적 유의성이 있다고 고려되었다.

결 과

치주병원균에 의한 황화합물 생성에서 프로바이오틱 의 효과

치주병원균에 의한 황화합물 생성 시 프로바이오틱스 의 효과를 조사하기 위하여 혼합배양을 실시하였다. 치주 병원균인 F. nucleatum 및 P. gingivalis를 프로바이오틱스 와 혼합 또는 단독배양 후, 휘발성 황 화합물을 가스 크 로마토그래프로 측정하였다. L. casei와 L. rhamnosus, 두 프로바이오틱스 모두 치주병원균에 의한 황화합물 생성 을 유의성 있게 억제시켰다(Fig. 1). L. rhamnosus에 비해 L. casei가 두 치주병원균에 의한 황화합물의 생성을 더 많이 억제시켰다(Table 1). L. casei의 경우 세가지 황화합 물에 대하여 적게는 대략 20% (H₂S)에서 많게는 2% (CH₃SH)까지 감소시켰으며, L. rhamnosus는 대략 40% (H₂S)에서 15% (CH₃SH)까지 감소시켰다.

프로바이오틱의 항균활성도 검사

L. casei와 L. rhamnosus에 의한 황화합물 생성 억제가 차이가 났다. 그래서 메커니즘을 조사하기 위해서, 치주 병원균의 성장 억제에 의해서 황화합물의 생성을 억제하 는지 조사하기 위해서 프로바이오틱스의 배양액으로 항 균활성도 검사를 수행하였다. CLSI에서 추천하는 방법으 로 항균활성도를 수행한 결과 L. casei 및 L. rhamnosus는 F. nucleatum과 P. gingivalis에 대하여 각각 배양액 12.5% 및 6.25%에서 항균활성을 나타내었다(Fig. 2). 그러나 두 프로바이오틱스에 대한 항균활성도의 차이는 보이지 않 았다.

L. casei 배양액에 의한 황화합물 억제

두 프로바이오틱스는 치주병원균의 황화합물 생성에 대한 억제 차이를 보였지만, 항균활성도에서는 차이를 보이지 않았다. 그래서 프로바이오틱스 배양액을 치주병 원균 배양액을 혼합하고 휘발성 황화합물을 측정하였다.

Fig. 3에서 보이는 바와 같이, L. casei의 경우 세 가 지 휘발성 황화합물의 양을 유의성 있게 감소시켰지만, L. rhamnosus는 디메틸설파이드만 감소시켰다. 프로바이 틱스 배양 배지에 의한 영향인지 살펴보기 위해서 가상 대조군(mock control)으로 사용하였다.

고 찰

구취환자 중 대부분이 구강세균에 의한 원인으로 음 식물 섭취 또는 생리적인 작용보다 더 많이 차지하고 있다[4]. 구취는 구강세균 중 혐기성 세균에 의해서 주 로 발생하며, 이들 세균의 특징은 BANA 시험 양성 세 균들로[8], 트립신 유사 효소를 생성하여 cysteine이나 methionine이 들어있는 단백질을 분해하여 휘발성 황화 합물을 만든다[19]. 일시적인 구취는 대부분 음식에 의 한 원인이어서 구강가글제를 이용하여 비교적 쉽게 제 거될 수 있지만, 구강혐기성 세균이 관련된 만성 구취는 세균이 생성한 휘발성 황화합물이 혀 및 치은 열구액에 침착되면서 지속적으로 발생된다[1,3]. 구취 치료를 위해 서 물리적인 치료방법으로 치실을 사용하거나 화학적인 방법으로 구강가글제 사용이 일반적이었다[3,5]. 그러나 최근에는 프로바이오틱 세균인 Streptococcus salivarius K12를 이용한 구취치료를 위한 시도가 이루어졌다[20].

L. casei와 L. rhamnosus는 프로바오틱 세균으로 최근 에 이 세균들의 사람 면역 및 항균활성도 때문에 여러 가지 질병의 예방 및 치료에 사용되고 있다[12,21]. 특 히, 이 세균을 이용한 요거트를 이용한 임상실험 결과 치우아식에 예방이 있다고 보고되었다[17]. 그러나 아직 구취에 대한 연구는 이루지지 않았다.

본 연구에서 치주병원균인 F. nucleatum과 P. gingivalis 에 의해서 생성되는 휘발성 황화합물에 대해서 L. casei 및 L. rhamnosus 모두 유의적인 억제효과를 보였다. 치주 원병원균을 L. casei 및 L. rhamnosus와 혼합 또는 단독 배 양하였을 때, 혼합 배양한 곳에서 휘발성 황화합물의 양 이 적게는 20%, 많게는 4%까지 감소된 것을 확인하였으 며, 두 프로바이오틱 중에 L. casei가 휘발성 황화합물 생 성을 좀 더 많이 억제시키는 것으로 나타났다. 이러한 차 이가 lactobacilli가 갖고 있는 항균활성 때문인지 두 프로 바이오틱 세균 배양액을 분리하여 최소억제농도 시험을 수행한 결과, 두 프로바이오틱 간에 유의적인 차이를 보 이지 않았다. 그래서 차이를 보이는 원인이 다른 메커니 즘에 있을 것이 고려되어, L. casei 및 L. rhamnosus 배양 액과 F. nucleatum 및 P. gingivalis 배양액을 혼합하고 배 양액에서 방출되는 휘발성 황화합물의 양을 측정하였다. 그 결과 L. rhamnosus 배양액과 혼합한 용액에서는 수산 화황과 유화메틸만 유의적 감소를 보였지만 L. casei 배양 액과 혼합한 용액에서는 세 가지 휘발성 황화합물에서 유 의적인 감소를 보였다. Sreekumar 등의 연구결과에서 L. rhamnosus는 다른 프로바이오틱 세균보다 휘발성 황화합 물 중 수산화황과 유화메틸을 더 많이 생성하지만, 디메 틸설파이드는 적게 생성한다[22]. L. casei의 경우도 휘발 성 황화합물을 생성한다고 보고되고 있지만, 이번 실험에 서 사용한 균주인 L. casei ATCC 334만 유일하게 휘발성 황화합물을 생성하지 못한다[23]. 결국 두 프로바이오틱 세균의 배양액을 이용한 실험에서는 L. rhamnosus의 항균 활성에 의해서 치주병원균의 성장을 억제하지만 L. rhamnosus 세균 자체가 치주병원균에 의해서 생성시킨 양 만큼 휘발성 황화합물을 생성하여 차이를 보이지 않은 것 이며, L. casei는 항균활성에 의해서 치주병원균의 성장을 억제시킬 뿐만 아니라 L. casei가 분비하는 물질이 휘발성 황화합물에 부착하여 액체로부터 발산을 억제하는 사료 된다. 휘발성 황화합물 생성에 있어서 혼합배양 시에는 감소되지만 배양액을 혼합하였을 때는 감소하지 않는 결 과를 바탕으로 L. rhamnosus에 의한 휘발성 황화합물 생 성보다 치주병원균에 의한 휘발성 황화합물 생성이 더 많 다는 것이 예측된다. S. salivarious K12는 항균활성에 의 해서 구취를 감소시킨다고 보고되었지만[20], 본 연구에 서 수행한, 배양액을 이용하여 한 실험을 하여야 정확한 구취 감소효과를 예측할 수 있을 것이다.

본 연구에서는 기존 구취감소에 사용한 프로바이오틱 세균이 아닌 새로운 L. casei 및 L. rhamnosus를 이용하여 구취감소 효과를 체외실험을 통해서 조사하였다. 두 프로 바이오틱 모두 구취감소 효과를 보이지만 L. rhamnosus도 휘발성 황화합물을 생성하므로, L. casei ATCC 334가 구 취 치료 및 예방을 위한 프로바이오틱 세균으로 더 좋은 효과가 있을 것으로 사료된다.